椰子CnRADIALIS-like轉(zhuǎn)錄因子的克隆與表達(dá)分析

郭樹寬 曾春茹 吳翼 李靜 李新國 楊耀東

摘? 要：本研究依據(jù)前期已經(jīng)完成的4個品種椰子外果皮轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果，篩選獲得在4個品種椰子外果皮中表達(dá)水平顯著差異的MYB類基因CnRADIALIS-like。從椰子（Cocos nucifera L.）外果皮中克隆獲得CnRADIALIS-like，序列分析顯示，CnRADIALIS-like基因的開放閱讀框（ORF）長288 bp，編碼95個氨基酸。結(jié)構(gòu)域分析顯示，CnRADIALIS-like含有1個典型的SANT/MYB結(jié)構(gòu)域，屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的I-box-binding-MYB型。多序列比對發(fā)現(xiàn)，CnRADIALIS-like氨基酸序列與油棕MYB-RADIALIS（RAD）氨基酸序列相似度最高。理化性質(zhì)、親/疏水性和無序化分析顯示，CnRADIALIS-like轉(zhuǎn)錄因子是親水性蛋白且偏堿性，存在無序化區(qū)域。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明，其不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域?？臻g結(jié)構(gòu)分析顯示，CnRADIALIS-like有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）顯示，CnRADIALIS-like基因在4個品種椰子外果皮中的表達(dá)量存在顯著差異，在紅矮椰子中表達(dá)量最高，紅矮椰子不同組織中在外果皮表達(dá)量最高。該基因的表達(dá)在紅矮椰果從幼果至成熟果的3個發(fā)育階段依次降低，套袋條件下表達(dá)量低于正常光照條件下，表明該基因可能與光形態(tài)下細(xì)胞發(fā)育及代謝產(chǎn)物合成存在相關(guān)作用。通過對該基因的生物信息功能進(jìn)行分析，為深入研究其功能及作用機(jī)制提供參考，同時以期為深入剖析椰子的外果皮顏色形成機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：椰子;外果皮顏色;MYB家族;RAD蛋白

中圖分類號：S667.4????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Coconut CnRADIALIS-like Transcription Factor

GUO Shukuan1，2，3， ZENG Chunru2，3， WU Yi2，3， LI Jing2，3， LI Xinguo， YANG Yaodong2，3*

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China; 3. Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract： Based on the results of the transcriptome sequencing data of the four coconut exocarps that have been completed previously， the expression levels of a MYB gene， CnRADIALIS-like， show significant difference in four coconut exocarps with different color. CnRADIALIS-like was cloned from coconut （Cocos nucifera L.） exocarp. Sequence analysis showed that the open reading frame （ORF） of CnRADIALIS-like was 288 bp long， encoding 95 amino acids. The domain analysis showed that CnRADIALIS-like contains a typical SANT/MYB domain， which belongs to the I-box-binding-MYB type in the MYB transcription factor family. Multi-sequence comparison found that the amino acid sequence of CnRADIALIS-like had the highest similarity with the amino acid sequence of oil palm MYB-RADIALIS （RAD）. Physicochemical properties， affinity/hydrophobicity and disorder analysis showed that the CnRADIALIS-like transcription factor is a hydrophilic protein and alkalescent， with disordered regions. Analysis of signal peptide and transmembrane domain showed that there was no signal peptide and transmembrane domain. Spatial structure analysis shows that CnRADIALIS-like had a typical α-helical structure. Real-time fluorescent quantitative PCR （qRT-PCR） showed that the expression levels of CnRADIALIS-like were significantly different in the epicarp with different color， and the highest expression was observed in the red dwarf coconut. This gene showed the highest expression in the epicarp in comparison with other tissues of the red dwarf coconut. The expression of the gene decreased in the three developmental stages of red dwarf coconut from young fruit to mature fruit. The expression level under bagging conditions was lower than under normal light conditions， indicating that this gene may be related to cell development and metabolite synthesis under light morphology effect. The bioinformatic analysis of this gene would provide a reference for in-depth study of its functiona， and at the same time， it would also provide an important theoretical basis for the role of this gene in the formation of epicarp color of coconut.

Keywords： coconut; exocarp color; MYB family; RAD protein

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.006

椰子（Cocos nucifera L.）為棕櫚科椰子屬多年生熱帶木本油料和食品能源植物，是分布最廣、栽培面積最大的熱帶果樹種類之一[1]。椰子在我國已有2000多年的栽培歷史，是營養(yǎng)豐富的天然有機(jī)食品，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值[2]。而果皮顏色是椰子的重要品質(zhì)性狀，椰子具有橙紅、金黃、綠色、褐色等多種果皮顏色，且果皮顏色很大程度上決定著果實(shí)的商品價值，因此，研究椰子果皮顏色的形成機(jī)制，對于椰子種質(zhì)資源創(chuàng)新與開發(fā)利用具有重要意義[3]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄家族之一，在植物生長發(fā)育、細(xì)胞形態(tài)、次級代謝等方面發(fā)揮重要作用[4-5]，與動物中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子相比，植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子的第3個重復(fù)中的第1個色氨酸殘基被苯丙氨酸或異亮氨酸殘基所替換，C端序列則具有高度多樣性，從而保證MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能多樣性[6-7]。早在1987年，Paz-Ares等[8]從玉米（Zea mays）中克隆出第1個參與類黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子Colorless1（C1）后，相繼克隆到其他MYB轉(zhuǎn)錄因子。MYB家族廣泛參與花青素等次生代謝產(chǎn)物的生物合成，從而參與植物著色形成，而類胡蘿卜素與花青素廣泛存在于植物花瓣、果實(shí)的細(xì)胞液組織及莖葉的表面細(xì)胞中，賦予植物多彩的顏色[9]。為研究MYB家族轉(zhuǎn)錄因子對椰子外果皮的著色調(diào)控機(jī)制，本試驗前期對4個不同品種椰子外果皮組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出與黃酮類等次生代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的33個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，對該家族基因進(jìn)行克隆及熒光定量表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)MYB-RAD家族中的CnRADIALIS- like基因在4個品種中的表達(dá)差異達(dá)顯著水平，并且在紅矮椰果外果皮中的表達(dá)量顯著高于其他3個品種，推測其可能與紅矮椰果外果皮顏色形成存在一定相關(guān)性，因此將該基因作為調(diào)控椰果外果皮顏色的候選基因之一。但目前對于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的RADIALIS（RAD）的研究相對較少，作為MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的RAD蛋白，其研究主要集中于花的不對稱性方向的調(diào)控作用，并且已證實(shí)在早期花分生組織的背側(cè)區(qū)域特異表達(dá)[10]。在藍(lán)豬耳（Torenia fournieri Linden. ex Fourn.）中，發(fā)現(xiàn)TfCYC2和TfRAD1在花的背側(cè)區(qū)域和花冠色素沉著中高度表達(dá)[11]。目前，已有大量的MYB-RAD基因從植物中分離出來，但只有少數(shù)基因的功能已被證實(shí)，而椰子MYB家族轉(zhuǎn)錄因子成員結(jié)構(gòu)及其在椰子外果皮的功能研究未見報道。

為探索椰子MYB家族轉(zhuǎn)錄因子成員結(jié)構(gòu)及其在椰子外果皮的功能，本研究從椰子外果皮中克隆MYB-RAD轉(zhuǎn)錄因子基因（CnRADIALIS- like）并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，了解該基因的理化特性，為進(jìn)一步研究該基因功能及蛋白互作等提供重要參考，并且為深入研究椰子MYB家族轉(zhuǎn)錄因子成員的結(jié)構(gòu)和功能及揭示椰子外果皮顏色的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料：均取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所種質(zhì)資源圃，于2020年6月28號采集7～8月果齡的紅矮、黃矮、褐矮及香水4個不同品種的椰果為品種間基因表達(dá)驗證比較材料;采集紅矮椰子果齡為3、5、7月3個不同發(fā)育階段的椰果;采集紅矮椰子套袋45 d的約7月果齡椰果和同株樹未套袋生長階段基本相同的椰果為對照。椰果帶回實(shí)驗室取外果皮并分裝至液氮中速凍，–80 ℃保存?zhèn)溆?。根、莖、葉取自紅矮椰子幼苗，雄花、雌花取自紅矮椰子未授粉花朵，清洗干凈裝袋放入液氮中，帶回實(shí)驗室存于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗耗材：通用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒、Mighty Script Plus第一鏈cDNA合成Master Mix（去基因組DNA）、San Prep柱式DNA膠回收試劑盒、San Prep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、pMD18-T載體及DNA Markers等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;大腸桿菌DH5α購自日本TaKaRa公司;由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成與質(zhì)粒測序;其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：M400磨樣機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、超微量核酸蛋白儀、梯度PCR儀、凝膠電泳儀、凝膠紫外成像儀、切膠回收儀、冷凍高速離心機(jī)、高溫高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床等。

1.2? 方法

1.2.1? 椰子總RNA提取及cDNA合成? 取出超低溫保存的紅矮、黃矮、褐矮、香水椰果外果皮及椰子不同組織凍干樣本，用研磨儀（MM 400， Retsch）研磨（30 Hz， 1 min）至粉末狀，按照生工生物工程（上海）股份有限公司RNA提取試劑盒中操作說明提取樣品RNA，采用Mighty Script Plus第一鏈cDNA合成Master Mix（去基因組DNA）試劑盒將所得樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 引物設(shè)計及目的基因克隆? 根據(jù)椰果外果皮轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列CnRADIALIS-like（GenBank登錄號：MW289067），并利用NCBI及Primer 5設(shè)計特異性引物CnRADIALIS-like For和CnRADIALIS-like Re，引物序列見表1。以紅矮品種椰果外果皮cDNA為模板擴(kuò)增目的片段全長。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定挑選陽性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3? CnRADIALIS-like基因序列生物信息學(xué)分析? 利用ProtParam、TMHMM Server v.2.0、SignalP-5.0 Server、DeepLoc-1.0、SMART、PSIPRED V4.0等在線分析軟件對CnRADIALIS- like氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用BioEdit和MEGA-X進(jìn)行多序列比對;以MEGA-X中的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap設(shè)為1000），用于系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析的其他物種的MYB氨基酸序列均下載自NCBI。

1.2.4? CnRADIALIS-like基因表達(dá)分析? 依據(jù)CnRADIALIS-like基因序列通過Primer3 input在線設(shè)計特異性熒光定量引物CnRADIALIS-like RT2For和CnRADIALIS-like RT185Re，引物序列見表1。以不同樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋5倍后為模板，參照Monad公司的Mon AmpTM SYBR? Green qPCR Mix （Low ROX）試劑盒的操作步驟進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析，反應(yīng)在QuantStudio3熒光定量PCR儀上運(yùn)行，PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán);以椰子的Co-Actin基因為內(nèi)參基因（Co ACT-1F： ATAAAGTATGGCTGATGCTGAGG， Co ACT-1R： CAACAATGCTTGGGAACACA），每個樣品設(shè)3次重復(fù)，采用2–ΔΔCT法進(jìn)行定量分析。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及方差分析，通過SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素ANOVA檢驗及差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? RNA質(zhì)量濃度檢測

椰子外果皮RNA提取完成后進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測（圖1A），RNA完整性較好;再利用超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA質(zhì)量，OD值均在1.8～2.1之間，說明RNA純度較高沒有其他污染，可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)試驗。

2.2? CnRADIALIS-like基因克隆及序列分析

以椰子外果皮的cDNA為模板，CnRADIALIS- like For、CnRADIALIS-like Re為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增到的目的片段（圖1B），獲得一條250 bp處條帶。通過回收目的片段與pMD18-T載體連接，經(jīng)大腸桿菌菌液培養(yǎng)，再次通過菌液PCR驗證后，1%瓊脂糖電泳檢測獲得250 bp左右的基因片段（圖1C）。挑選陽性克隆菌液進(jìn)行測序分析，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果比對，目的基因全長序列為288 bp，將基因編碼區(qū)序列進(jìn)行比對，確定成功克隆獲得CnRADIALIS-like基因?；騉RF全長288 bp，編碼95個氨基酸（圖2A），將該基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，并命名為CnRADIALIS-like（GenBank登錄號：MW289067）。

2.3? CnRADIALIS-like蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析

利用ProtParam在線預(yù)測分析CnRADIALIS- like蛋白的理化性質(zhì)，得到其分子量為10 814.03 Da，分子式為C470H746N144O148S 理論等電點(diǎn)（pI）為9. 帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為13個，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）為15個，不穩(wěn)定系數(shù)為73.36（屬于不穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)為68.74，總平均親水性系數(shù)為–0.946（圖2B），故推測CnRADIALIS-like蛋白是一個不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.4? CnRADIALIS-like蛋白磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

利用NetPhos 3.1預(yù)測分析CnRADIALIS-like蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果（圖2D）顯示CnRADIALIS- like肽鏈中可能發(fā)生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位點(diǎn)有10個，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)8個、蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)2個、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)0個。由于CnRADIALIS-like肽鏈以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)為主，推測CnRADIALIS-like蛋白是以絲氨酸為主、蘇氨酸為輔的磷酸化修飾調(diào)控其生物功能。利用TMHMM Server v.2.0預(yù)測分析CnRADIALIS- like蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明CnRADIALIS-like蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP-5.0 Server預(yù)測分析CnRADIALIS-like蛋白的信號肽，結(jié)果顯示存在信號肽的概率為0.06%，故推測CnRADIALIS-like是非分泌蛋白（圖2C）。利用DeepLoc-1.0預(yù)測分析CnRADIALIS-like蛋白亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞核中。

2.5? CnRADIALIS-like蛋白保守結(jié)構(gòu)域及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用在線分析工具SMART： Main page預(yù)測分析CnRADIALIS-like蛋白保守結(jié)構(gòu)域可知（圖3A），CnRADIALIS-like的保守結(jié)構(gòu)域存在1個SANT結(jié)構(gòu)域和1個low complexity，其位置分別在10～62和3～13氨基酸處，CnRADIALIS-like

氨基酸序列具有植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的特異性SANT/MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于MYB家族。利用PSIPRED V4.0預(yù)測分析CnRADIALIS- like蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主（圖3B），分別占52.63%和47.37%。利用SWISS-MODEL預(yù)測分析該蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其主要由螺旋和卷曲結(jié)構(gòu)組成，分析其三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)存在HTH結(jié)構(gòu)（螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋模式）與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合（圖3C）。

2.6? CnRADIALIS-like系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

將克隆到的CnRADIALIS-like測序結(jié)果與已報道的152個MYB-RAD基因的序列進(jìn)行同源進(jìn)化比對，構(gòu)建同源進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明，CnRADIALIS-like與MYB基因家族基因聚為一簇，單子葉植物中CnRADIALIS-like與棕櫚科植物油棕（NC_026005.1）相似度最高，親緣關(guān)系較近。雙子葉植物中與柑橘（NC_023048）、芝麻（NC_026151.1）、向日葵（NC_035448.2）等相似度較高。此外，從NCBI中下載其余17種植物的MYB-RAD轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，利用鄰接法與椰子CnRADIALIS-like蛋白序列比對建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示其與油棕（Elaeis guineensis）RADIALIS-like 3氨基酸聚集在一個分支上（圖5），表明這二者的同源性最高。

2.7? CnRADIALIS-like基因表達(dá)分析

對于不同品種而言，CnRADIALIS-like在紅矮椰果外果皮中表達(dá)量最高，約為香水椰子的9倍，褐矮椰果和黃矮椰果外果皮中的表達(dá)量也顯著高于香水椰子（圖6A）。CnRADIALIS-like基因在本研究檢測的6個椰子組織（根、莖、葉、雌花、雄花、外果皮）中均有表達(dá)，但其表達(dá)量存在差異。CnRADIALIS-like主要在外果皮、雌花、根和葉中高表達(dá)，莖和雄花中表達(dá)量較低，其中外果皮中的表達(dá)量顯著高于其他組織，約為莖的40倍，而雌花中的表達(dá)量是雄花的10倍（圖6B）。對于不同發(fā)育階段的紅矮品種椰果而言，CnRADIALIS-like在3月果齡、5月果齡和7月果齡的表達(dá)量依次下調(diào)，其中3月果齡外果皮中的表達(dá)量顯著高于5月果齡和7月果齡，3月果齡外果皮中的表達(dá)量約是7月果齡的3倍，是5月果齡的2倍多（圖6C）。對于不同光照處理而言，無套袋處理的紅矮椰果外果皮中的表達(dá)量顯著高于套袋45 d的紅矮椰果外果皮中的表達(dá)量，說明該基因可能參與光形態(tài)下細(xì)胞發(fā)育及代謝的相關(guān)過程（圖6D）。

3? 討論

目前，已有大量的MYB-RAD基因從植物中分離出來，但只有少數(shù)基因的功能已被證實(shí)。RAD是一種小蛋白，屬于I-box-binding-MYB型[12]，由約99個氨基酸組成，含有1個單一的MYB結(jié)構(gòu)域，為典型色氨酸殘基被酪氨酸取代，該結(jié)構(gòu)域大致跨越蛋白質(zhì)的N端三分之二[13]。RAD類基因從裸子植物開始就已經(jīng)存在，它是由MYB TFs進(jìn)化后期中的DIV基因進(jìn)化而來的，該基因可能通過缺失或選擇性剪接事件丟失了編碼MYBII結(jié)構(gòu)域的區(qū)域[14-17]。本研究從椰子外果皮中克隆得到的CnRADIALIS-like基因與RAD基因同源，序列分析表明RAD屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，MYB轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中廣泛存在，尤其存在于植物[18-20]的生長發(fā)育、生命周期和代謝過程中。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的RAD蛋白在不同的植物物種中起著不同的作用。在茄屬（Solanum L.）植物中，與RAD同源的SANT/MYB1-like1蛋白參與其果實(shí)和植株發(fā)育的早期階段[21-23]。而CnRADIALIS-like基因在紅矮椰子3月果齡、5月果齡和7月果齡不同果實(shí)成熟發(fā)育階段外果皮中的表達(dá)量依次減少，與該類蛋白參與植株發(fā)育早期階段相對一致。在唇形目（Lamiales）金魚草（Antirrhinum majus）中研究表明，RAD與DIV競爭與其他MYB樣蛋白的結(jié)合，稱為DRIF1和DRIF2（DIV和RAD相互作用因子），RAD通過抑制金魚草花背側(cè)區(qū)域的DIV和DRIFs之間的相互作用，以建立花分生組織中基因活性的不對稱模式[24]。在生長組織中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)RAD基因高表達(dá)，這表明RAD基因可能參與了組織發(fā)育。這與導(dǎo)致胚胎停滯的AtRL2突變表型以及擬南芥（Arabidopsis thaliana）中導(dǎo)致葉片面積減小的異位RAD表達(dá)的效應(yīng)是一致的[25]。當(dāng)植物在黑暗中生長時，RAD的過表達(dá)也阻止了下胚軸中頂端彎鉤處的形成，從而達(dá)到可以抑制植物生長的作用[26]。本研究中對椰果套袋處理的CnRADIALIS-like基因表達(dá)量顯著低于光照環(huán)境下，推測該基因的表達(dá)可能參與光形態(tài)下細(xì)胞的分化與發(fā)育過程，進(jìn)而影響外果皮表皮組織細(xì)胞中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查耳酮合酶（CHS）及二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）等花青素合成途徑關(guān)鍵合成酶的活性，進(jìn)而抑制花青素的合成和積累，導(dǎo)致紅矮椰果外果皮顏色由紅色褪變?yōu)榘咨虻S色，這與RAD類蛋白影響細(xì)胞分化和發(fā)育結(jié)果相對一致，但對于細(xì)胞如何參與代謝產(chǎn)物的影響還需要更深入的研究。在棉屬（Gossypium）中，GbRL1屬于RAD2分支，該基因在胚珠和胚珠組織中強(qiáng)烈表達(dá)，具有潛在的控制棉纖維生長的作用，為RAD類蛋白新功能提供了證據(jù)[26]。這種模式可能意味著RAD、DIV和CYC之間的相互作用途徑可能是唇形亞綱（Lamiidae）或菊亞綱（Asteridae）特有的。在番茄（Lycopersicon esculentum）的FSM1（RAD樣）和MYBI（DIV樣）蛋白中發(fā)現(xiàn)的類似拮抗相互作用與果實(shí)發(fā)育有關(guān)。水果SANT/MYB（FSM1）蛋白，是一種RAD同系物，與MYBI競爭FSB1[27]，而研究表明，F(xiàn)SM1的番茄植株對細(xì)胞的擴(kuò)增有抑制作用，特別是對那些具有較高擴(kuò)增潛力的細(xì)胞，如位于果皮維管束內(nèi)部的細(xì)胞[24， 26]。本研究中，套袋導(dǎo)致椰子外果皮RAD類CnRADIALIS-like基因表達(dá)量下降，推測其影響果實(shí)表皮細(xì)胞的擴(kuò)增，同時對果皮表皮細(xì)胞內(nèi)苯丙氨酸解氨酶、蠟質(zhì)、角質(zhì)、木質(zhì)素等合成酶的活性存在一定抑制作用，從而引起外果皮木質(zhì)化程度降低、顏色變淺及果皮亮度、飽和度增加，與RAD類蛋白參與果皮維管束細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果相對一致。

此外，在唇形花如藍(lán)豬耳中，TfCYC2和TfRAD1也在花的背側(cè)區(qū)域和花冠色素沉著中高度表達(dá)[11]。而本研究中克隆到的CnRADIALIS-like基因在椰子外果皮中的表達(dá)量顯著高于其他組織，并且在4個不同顏色品種椰子外果皮的表達(dá)量存在顯著差異，由此推測其可能參與椰子外果皮顏色形成的過程。目前對RAD和DIV同源物的進(jìn)化和/或表達(dá)的研究集中在選定的核心真雙子葉植物上，包括川續(xù)斷屬（Dipsacus Linn.）、豆科（Leguminosae sp.）、車前（Plantago asiatica L.）和茄目（Silanales）[15， 27-30]。已有少數(shù)開展非核心真雙子葉植物的研究，特別是單子葉植物中鑒定出RAD和DIV基因[14， 17]。單子葉植物（蘭科Orchidaceae）的稀有表達(dá)評估中揭示了可能的冗余功能，表明RAD/DIV基因的調(diào)控有一定程度的保守性。因此，單子葉植物中得到的RAD基因為其功能擴(kuò)展提供了更加廣泛的可能性。

綜上所述，從單子葉植物椰子中克隆到的RAD類型基因，通過參考前人對MYB-RAD基因的研究進(jìn)展，完善了MYB-RAD基因家族成員信息，為該基因家族后續(xù)研究，以及為揭示椰子外果皮顏色形成機(jī)理提供理論依據(jù)，但對其參與代謝產(chǎn)物功能的驗證及其蛋白互作機(jī)制的揭示仍需進(jìn)一步的研究。

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