劉紅梅,張存艷,葉 強(qiáng),張廷模,郭 力*
? 藥材與資源 ?
基于DNA條形碼技術(shù)對(duì)喉紅石斛的植物學(xué)分類(lèi)研究
劉紅梅1, 2,張存艷1,葉 強(qiáng)1,張廷模1,郭 力1*
1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611137 2. 電子科技大學(xué),四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部(個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),四川 成都 611731
利用DNA條形碼技術(shù)探索喉紅石斛的分類(lèi)歸屬問(wèn)題,并建立一種新的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息挖掘方法。提取分屬5個(gè)組14種石斛的DNA,對(duì)ITS序列(ITS1-5.8 S-ITS2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)序,獲得ITS序列;基于序列信息,計(jì)算遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),對(duì)ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并對(duì)其進(jìn)行量化、聚類(lèi)分析。喉紅石斛與黑毛組的矮石斛、長(zhǎng)距石斛的遺傳距離最小,NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)聚類(lèi)圖均顯示喉紅石斛與黑毛組石斛聚為一支,且喉紅石斛與黑毛組石斛的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖基本一致。喉紅石斛與黑毛組石斛的親緣關(guān)系最近,應(yīng)歸屬于黑毛組;新建立的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)量化分析方法可提供更多的分類(lèi)信息,具有更高水平的分類(lèi)潛能。這是首次運(yùn)用DNA條形碼進(jìn)行石斛組間的分類(lèi)研究,為石斛屬植物系統(tǒng)提供了重要依據(jù)。
喉紅石斛;DNA條形碼;ITS;二級(jí)結(jié)構(gòu);分類(lèi)鑒定
石斛屬Sw.是蘭科(Orchidaceae)植物中最大的屬之一[1],大約有1200~1500種,主要分布于亞洲與澳洲[2],具有良好的藥用與觀賞價(jià)值。自1995年以來(lái),《中國(guó)植物志》收載了76種石斛屬植物,包括74種石斛和線葉石斛的2個(gè)變種,依據(jù)形態(tài)學(xué)分類(lèi)法被分為12個(gè)組[3];自2016年起《中國(guó)植物志》網(wǎng)絡(luò)版新收載了喉紅石斛[4],為單列品種,尚未歸類(lèi)。有研究指出喉紅石斛與矮石斛(黑毛組)形態(tài)相似[5],認(rèn)為其隸屬于黑毛組;然而石斛種類(lèi)繁多,外觀形態(tài)均相似,石斛屬內(nèi)的分類(lèi)鑒別歷來(lái)是蘭科植物分類(lèi)中最復(fù)雜的難題[6-7],僅依據(jù)與矮石斛的外觀形態(tài)進(jìn)行歸屬,略顯證據(jù)不足。
DNA條形碼鑒定是近年來(lái)生物分類(lèi)與鑒定的研究熱點(diǎn),是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段進(jìn)行物種鑒定和分類(lèi)的技術(shù)[8]。該技術(shù)不受物種形態(tài)學(xué)特征與發(fā)育階段的限制,且不受藥材狀態(tài)的限制,新鮮材料、干燥后材料、加工炮制后的材料都可以運(yùn)用該技術(shù),彌補(bǔ)了經(jīng)典分類(lèi)學(xué)性狀相似且不穩(wěn)定、易受外界因素影響等缺點(diǎn)[9-10]。目前DNA條形碼技術(shù)被廣泛應(yīng)用于石斛的鑒定[11-13],《中國(guó)植物志》中僅喉紅石斛尚未進(jìn)行歸屬,而將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于石斛組間的分類(lèi)鮮有報(bào)道。
目前石斛的分子鑒定主要基于核基因(ITS、IGS)與質(zhì)基因(、、、)[14-17],其中核DNA(rDNA)ITS序列表現(xiàn)出較高的突變率與進(jìn)化率,是鑒別石斛種屬水平最常用的條形碼。此外,ITS2序列在物種水平或種下水平具有明顯的序列變異性,其二級(jí)結(jié)構(gòu)可提高系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建的穩(wěn)定性,為物種在分類(lèi)水平上提供更多信息。然而,目前對(duì)石斛ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息挖掘較少且大部分停留在“分子形態(tài)”層面[18],即分析ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的四個(gè)螺旋臂形態(tài)差異,未見(jiàn)“數(shù)據(jù)化”分析。本研究建立了一種新的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息挖掘方法,結(jié)合rDNA ITS條形碼的序列分析、遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系探究喉紅石斛的分類(lèi)歸屬,豐富DNA條形碼技術(shù)在植物系統(tǒng)進(jìn)化與分類(lèi)的應(yīng)用。
本研究所用14種石斛采自四川、云南,由成都中醫(yī)藥大學(xué)張廷模教授鑒定,樣品信息見(jiàn)表1。
表1 石斛樣品信息
全自動(dòng)冷凍球磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司),Sartorius BP121s電子分析天平(Sartorius公司,德國(guó)),UPT-II-107優(yōu)普系列超純水器(成都超純水科技有限公司),T100 PCR儀、自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白檢測(cè)儀,電泳儀、電泳槽(Bio-Rad公司,美國(guó));MK200-2型干式恒溫箱(杭州奧盛儀器有限公司)、Allegra X-30R Centrifuge高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter公司,美國(guó))、HVE-50型高壓蒸汽滅菌器(Hirayama公司,日本)、VOREX-5型渦旋混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);植物DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司);引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。
取各石斛樣品約100 mg,加入液氮后,用快速球磨儀研磨3 min (30次/s),用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。以樣品DNA作為模板,對(duì)ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增,正向引物P1:5’-CGTAACAAGGTT- TCCGTAGGTGAAC-3’,反向引物P2:5’- TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’。反應(yīng)體系為:25 μL 2×Easy Taq PCR Super Mix,正反引物各2.0 μL,1.0 μL模板DNA和20 μL蒸餾水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃變性3 min;94 ℃變性40 s;56.4 ℃退火40 s;72 ℃延伸5 min,循環(huán)35次。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度后,送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
將所得的測(cè)序峰圖利用Codon Code Aligner V 6.0.2 (Codon Code Co.,美國(guó))進(jìn)行校對(duì)拼接,除去引物區(qū)和低質(zhì)量的序列,將獲得的序列提交到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)進(jìn)行Blast比對(duì),獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS1-5.8 S-ITS2與ITS2間隔區(qū)序列。采用 MEGA 5.0計(jì)算K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離,同時(shí)截取云南石仙桃此區(qū)域序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的外族群,構(gòu)建鄰接(neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并根據(jù)Bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率,對(duì)ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)。測(cè)量二級(jí)結(jié)構(gòu)四個(gè)螺旋的長(zhǎng)度、角度以及每個(gè)螺旋環(huán)的個(gè)數(shù),采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。
由表2可知,14種石斛的ITS序列有327個(gè)變異位點(diǎn),變異率為50.9%;5.8 S序列有20個(gè)變異位點(diǎn),變異率為12.3%;ITS1序列有157個(gè)變異位點(diǎn),變異率為65.6%;ITS2有150個(gè)變異位點(diǎn),變異率為60.5%,變異率大小順序:ITS1>ITS2>ITS>5.8 S。由此可見(jiàn),5.8 S基因序列趨于保守,在物種間變化小,而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū),變異率在60%以上,這也是選擇ITS序列作為石斛分類(lèi)的基礎(chǔ)。此外,鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶所占的比率稱(chēng)為GC含量,GC含量越高,DNA的密度也越高,且熱及堿穩(wěn)定性也越高,ITS區(qū)域的GC含量在47.2%~54.5%(平均含量為52.0%),5.8 S的GC含量在56.4%~59.6%(平均含量為58.3%),ITS1的GC含量在43.2%~53.3%(平均含量為48.9%),ITS2的GC含量在44.7%~54.7%(平均含量為50.6%),GC含量由小到大順序?yàn)镮TS1<ITS2<ITS<5.8 S。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GC含量的大小順序與變異率的順序恰好相反,由此可以得出結(jié)論:GC含量越低,DNA序列的穩(wěn)定性相對(duì)較低,則變異率越高。
蘭科石仙桃屬植物與石斛屬植物非常相似,以截取的云南石仙桃(AF362911)ITS序列為外族群,與14種石斛的ITS序列建立遺傳距離矩陣(表3)。
表2 14種石斛的ITS序列信息
表3 石斛種間遺傳距離分析
由表3可知,14種石斛的種間遺傳距離在0~0.293,其中草葉組間的遺傳距離為0.056,頂葉組間的遺傳距離為0.148,黑毛組間的遺傳距離為0.026,石斛組間的遺傳距離為0.119~0.155,不同組間的遺傳距離具有差異性。草葉組與黑毛組的組間遺傳相似度高,與其他組的遺傳距離均在0.224以上,黑毛組與其他組的距離均在0.113以上,表明草葉組和黑毛組的組內(nèi)接受率高,且組間拒絕率高,更宜用于組間的鑒別與分類(lèi)研究。而喉紅石斛與黑毛組中矮石斛與長(zhǎng)距石斛的遺傳距離最低,分別為0、0.026。因此,從遺傳距離的角度分析,喉紅石斛更支持歸屬于黑毛組。此外,14種石斛與外族種云南石仙桃的遺傳距離范圍為0.239~0.360,總體上高于石斛屬內(nèi)遺傳距離,表明石斛屬內(nèi)的遺傳分化程度低于外族群。
根據(jù)ITS1-5.8 S-ITS2序列對(duì)所有石斛樣品與云南石仙桃構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),利用Bootstrap 1000次檢驗(yàn)各分支的支持率(圖1)。
由NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知,草葉組石斛的親緣關(guān)系很近,梳唇石斛和單葶草石斛以100%的支持率聚為一支,且與劍葉組的刀葉石斛比較近,但支持率僅44%;石斛組的曲軸石斛、細(xì)葉石斛、蘇瓣石斛、美花石斛、羅河石斛與線葉石斛這6種石斛以53%的支持率聚為一支;頂葉組的具槽石斛與聚石斛的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),未被聚為一支;喉紅石斛與黑毛組的矮石斛、長(zhǎng)距石斛以100%的支持率聚為一支。由此可以看出,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聚類(lèi)結(jié)果同樣支持喉紅石斛歸屬于黑毛組,與K2P遺傳距離的分析結(jié)果一致。
圖1 14種石斛的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ法)
基于14種石斛的ITS2序列,預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2),可以看出二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)螺旋區(qū)組成(Helix Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),通過(guò)統(tǒng)計(jì)14種石斛二級(jí)結(jié)構(gòu)的螺旋夾角、長(zhǎng)度以及莖環(huán)數(shù)目(表4),采用“組間連接”方法,并以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析(圖3)。
從二級(jí)結(jié)構(gòu)的“分子形態(tài)”(圖2)可以看出,矮石斛、長(zhǎng)距石斛與喉紅石斛的二級(jí)結(jié)構(gòu)完全一致,該結(jié)果與遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致,同樣支持將喉紅石斛歸屬于黑毛組。其余大部分石斛的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性,螺旋環(huán)的長(zhǎng)度、莖環(huán)數(shù)目以及螺旋之間的角度都存在差異。將二級(jí)結(jié)構(gòu)“量化”后(圖3),可以明顯看出,除矮石斛、長(zhǎng)距石斛、喉紅石斛被聚為一類(lèi)外,石斛組的美花石斛、羅河石斛、細(xì)葉石斛與曲軸石斛也被聚為一類(lèi),表明“量化”的二級(jí)結(jié)構(gòu)能避免肉眼觀察的局限性,提供更多客觀的石斛組間分類(lèi)信息。此外,石斛組的蘇瓣石斛與線葉石斛未與其他4種石斛組石斛聚為一類(lèi),草葉組與頂葉組的2種石斛也未被聚為一類(lèi),表明同組石斛的種間差異或可通過(guò)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分與鑒別。
圖2 14種石斛的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)
表4 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的量化信息
圖3 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)聚類(lèi)圖
基于DNA條形碼的分子技術(shù)是分類(lèi)鑒定的最新進(jìn)展,近年來(lái),DNA條形碼在物種鑒定與分類(lèi)方面得到了快速發(fā)展,并迅速成為了研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定及其他分子標(biāo)記技術(shù)相比,DNA條形碼技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性高、結(jié)果可靠[8]的優(yōu)勢(shì)。目前,DNA條形碼在石斛中的應(yīng)用非常廣泛,包括物種鑒定、系統(tǒng)分類(lèi)、物種進(jìn)化、植物育種、資源保護(hù)等領(lǐng)域[7]。
喉紅石斛作為《中國(guó)植物志》石斛屬下唯一未被分類(lèi)的品種,其分類(lèi)歸屬問(wèn)題亟待解決。前人[5]根據(jù)外觀形態(tài)指出喉紅石斛與矮石斛相似,應(yīng)歸屬于黑毛組。本文從石斛的rDNA ITS序列信息、遺傳距離、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)多方面對(duì)喉紅石斛的分類(lèi)進(jìn)行研究,均發(fā)現(xiàn)喉紅石斛與黑毛組石斛的親緣關(guān)系非常接近,因此認(rèn)為喉紅石斛應(yīng)該被歸為黑毛組石斛,本研究結(jié)果更加可靠,且為DNA條形碼作為石斛分類(lèi)以及系統(tǒng)發(fā)育的研究提供了有力證據(jù)。
陳士林等[8]指出二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異主要體現(xiàn)在以下3點(diǎn):①HelixⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ之間的夾角;②Helix Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的長(zhǎng)度;③HelixⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ上面莖、環(huán)的數(shù)目與形狀?;诖耍狙芯吭谝酝鶕?jù)遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分類(lèi)鑒定研究的基礎(chǔ)上,建立了一種新的利用ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的方法,該方法打破了以往“看圖說(shuō)話”的主觀分析模式,首次將二級(jí)結(jié)構(gòu)圖的差異性“量化”,為物種鑒定與分類(lèi)提供更多、更準(zhǔn)確的信息。如草葉組的梳唇石斛與單葶草石斛,其遺傳距離(0.056)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(100%支持率)結(jié)果都顯示它們親緣關(guān)系非常近,筆者通過(guò)ITS2序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)統(tǒng)同樣顯示兩者的支持率為100%,這也導(dǎo)致二者種間鑒別比較困難,而通過(guò)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)圖以及二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析可以明顯將兩者區(qū)分開(kāi),該結(jié)果表明ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息具有用于植物更高水平的分類(lèi)與鑒別研究的潛能,與遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可以進(jìn)行相互驗(yàn)證與補(bǔ)充,整套方法體系更加科學(xué)完整,為石斛屬植物的不同水平上分類(lèi)研究提供了可靠的方法。同時(shí)也為其他植物的DNA條形碼的進(jìn)一步研究提供借鑒與參考。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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Botanical Classification ofbased on DNA barcode technology
LIU Hong-mei1, 2, ZHANG Cun-yan1, YE Qiang1, ZHANG Ting-mo1, GUO Li1
1. State Key of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Personalized Drug Therapy Key Laboratory of Sichuan Province, Department of Pharmacy, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 611731, China.
To explore the classification ofby using DNA barcode technology, and establish a new information mining method for ITS2 secondary structure.Extraction of DNA from 14 Dendrobium species belonging to 5 groups. The ITS sequence (ITS1-5.8 S-ITS2) was amplified by PCR and sequenced to obtain ITS sequence. Based on the sequence information, the genetic distance was calculated and the phylogenetic tree was constructed. The secondary structure is predicted, quantified and clustered.The genetic distance ofare closest toandbelong to Section Formosae. NJ phylogenetic tree and ITS2 secondary structure cluster diagram also showed thatand Dendrobium species which belong to Section Formosae were divided into one branch. The secondary structure ofis consistent with that of Section Formosae.The relationship among theand Dendrobium species of Section Formosae are the closest, andshould be categorized as the Section Formosae. The newly established quantitative analysis method of ITS2 secondary structure can provide more classification information and have higher classification potential. This is the first time that DNA barcode has been used to classify and identify among Dendrobium groups, which provides an important basis for the identification and classification of Dendrobium resources.
Rchb. f.; DNA barcode; ITS; secondary structure; taxonomy and identification
R282.12
A
0253 - 2670(2021)21 - 6656 - 07
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.023
2021-03-06
國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)家基礎(chǔ)人才培養(yǎng)項(xiàng)目(J1310034-18);國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2017YFC1701804);成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(CXTD2018012)
劉紅梅(1992—),女,博士,從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。Tel: 18215529213 E-mail: liuhongmei@stu.cdutcm.edu.cn
郭 力,男,博士,博士生導(dǎo)師,從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail: guoli@cdutcm.edu.cn
[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]