基于鹽炙前后成分煎出差異與止瀉作用相關(guān)性探討補(bǔ)骨脂丸增效機(jī)制

毋啟桐，王金金，楊安南，周 寧, 2，趙 強(qiáng)，李 凱, 2*，張振凌, 2*

基于鹽炙前后成分煎出差異與止瀉作用相關(guān)性探討補(bǔ)骨脂丸增效機(jī)制

毋啟桐1，王金金1，楊安南1，周 寧1, 2，趙 強(qiáng)3，李 凱1, 2*，張振凌1, 2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046 2. 河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046 3. 湖北省藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評(píng)核查中心，湖北 武漢 430071

探討鹽炙對(duì)補(bǔ)骨脂丸中代表性成分煎出的影響，以及成分與止瀉藥效的相關(guān)性。采用HPLC-MS法測(cè)定補(bǔ)骨脂丸及3種補(bǔ)骨脂丸模擬品水煎液中13種代表性成分的含量差異，并結(jié)合不同給藥組對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉模型大鼠的胃腸激素和下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)指標(biāo)的影響，采用灰色關(guān)聯(lián)分析法，對(duì)代表性成分與止瀉藥效進(jìn)行相關(guān)性分析，尋找藥效貢獻(xiàn)較大成分。與3種模擬品（模擬I～I(xiàn)II號(hào)）相比，補(bǔ)骨脂丸水煎液中黃酮類成分如蘆丁、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、異補(bǔ)骨脂查耳酮及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的含量較高，揮發(fā)油類成分如茴香醛、反式茴香腦及補(bǔ)骨脂酚的含量較低；與模擬II、III號(hào)相比，香豆素類成分如補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的含量較低。不同成分對(duì)止瀉藥效的貢獻(xiàn)具有差異，黃酮類和揮發(fā)油類成分與止瀉藥效的關(guān)聯(lián)度較高，香豆素類成分（如補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素）與止瀉藥效的關(guān)聯(lián)度較低。補(bǔ)骨脂、小茴香鹽炙后組成補(bǔ)骨脂丸，能促進(jìn)黃酮類成分煎出，抑制揮發(fā)油類、香豆素類成分煎出，這可能是鹽炙增強(qiáng)其止瀉作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

補(bǔ)骨脂丸；補(bǔ)骨脂；小茴香；鹽炙；配伍；止瀉；HPLC-MS；脾腎陽(yáng)虛；灰色關(guān)聯(lián)分析；黃酮；香豆素；揮發(fā)油

補(bǔ)骨脂丸來源于宋《魏氏家藏方》[1]，由鹽補(bǔ)骨脂和鹽小茴香組成，治腎氣虛冷、小便無(wú)度。鹽炙主要作用為“引藥下行走腎經(jīng)”，補(bǔ)骨脂、小茴香鹽炙后配伍使用功效更著，入下焦則溫腎散寒，入中焦則溫脾暖胃。但鹽炙后中藥配伍增效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究還相對(duì)缺乏?；疑P(guān)聯(lián)分析法通常用來明確因素間關(guān)聯(lián)程度，通過比較2個(gè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)發(fā)展曲線的接近程度，來推測(cè)系統(tǒng)間關(guān)聯(lián)強(qiáng)弱，發(fā)展曲線越接近，即變化趨勢(shì)越接近，關(guān)聯(lián)度就越大[2]，近年來常被用來探討成分與藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，從而探尋中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

補(bǔ)骨脂丸中主要含有香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分[3-4]。湯劑是臨床主要應(yīng)用形式，補(bǔ)骨脂、小茴香為臨床常用藥對(duì)，既可作為傳統(tǒng)丸劑，也可作為湯劑使用，為便于研究，本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)骨脂丸及3種補(bǔ)骨脂丸模擬品（模擬I號(hào)：鹽補(bǔ)骨脂、生小茴香；模擬II號(hào)：生補(bǔ)骨脂、鹽小茴香；模擬III號(hào)：生補(bǔ)骨脂、生小茴香）制備成水煎液，采用HPLC-MS法測(cè)定不同組合樣品水煎液中香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類等共13種代表性成分含量差異，并結(jié)合相關(guān)止瀉藥效指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，探討成分與藥效之間的相關(guān)性，從而豐富中藥鹽炙增效的科學(xué)內(nèi)涵。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20ADXR型高效液相色譜儀，配SPD-M20A檢測(cè)器，LCMS-2020單四級(jí)桿質(zhì)譜儀，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；BT25S型十萬(wàn)分之一分析天平，賽多利斯科技儀器有限公司；FA2104B型電子天平，上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司；TGL-16M型高速冷凍離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DZTW型電子調(diào)溫電熱套，天津工業(yè)實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)骨脂，批號(hào)180301，亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司，產(chǎn)地河南，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂Linn.的干燥成熟果實(shí)；小茴香，批號(hào)170101，亳州市永剛飲片廠有限公司，產(chǎn)地甘肅，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為傘形科茴香屬植物茴香Mill.的干燥成熟果實(shí)；對(duì)照品補(bǔ)骨脂素（批號(hào)C12J8Q39802）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)Y18O8H46134）、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮（批號(hào)YM0509HA14）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（批號(hào)ZN1112BD13）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮（批號(hào)C19J8G28797）、補(bǔ)骨脂寧（批號(hào)ZN1112BA13）、補(bǔ)骨脂定（批號(hào)Y06J9S65151）、異補(bǔ)骨脂查耳酮（批號(hào)Y23J9H64242）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（批號(hào)Y21J3S1）、補(bǔ)骨脂酚（批號(hào)YM0320SA14）、蘆?。ㄅ?hào)Y16M9S61523）、茴香醛（批號(hào)H04J10Z78823）、反式茴香腦（批號(hào)Y24N6S6391）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 鹽補(bǔ)骨脂 取凈補(bǔ)骨脂1.5 kg，加食鹽水（100 kg補(bǔ)骨脂用食鹽2 kg）拌勻，悶潤(rùn)4 h，置炒鍋中，以文火（120～150 ℃）加熱，炒制8.5 min，待表面黑色或黑褐色，微鼓起，氣微香，味微咸時(shí)取出，放涼[5]。

2.1.2 鹽小茴香 取凈小茴香1.5 kg，用食鹽水（100 kg小茴香用食鹽2 kg）拌勻，悶潤(rùn)，待食鹽水被吸盡后，置炒鍋內(nèi)，以文火（120～150 ℃）加熱，炒至微黃、微鼓起，色澤加深，偶有焦斑，味微咸時(shí)，出鍋，晾涼[6]。

2.1.3 補(bǔ)骨脂丸 由鹽補(bǔ)骨脂、鹽小茴香等比例組成；補(bǔ)骨脂丸模擬I號(hào)、II號(hào)、III號(hào)分別由鹽補(bǔ)骨脂、生小茴香，生補(bǔ)骨脂、鹽小茴香，生補(bǔ)骨脂、生小茴香等比例組成。

2.2 檢測(cè)條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbox Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件：0～2 min，5%～20%乙腈；2～5 min，20%～32%乙腈；5～10 min，32%乙腈；10～11 min，32%～45%乙腈；11～23 min，45%乙腈；23～31 min，45%～90%乙腈；31～33 min，90%～5%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜參數(shù) 電噴霧離子源（ESI），選擇性掃描模式，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，離子源噴霧電壓4.5 kV/?3.5 kV，加熱模塊溫度350 ℃，脫溶劑氣溫度250 ℃，霧化氣體積流量1.5 L/min，干燥氣體積流量15 L/min。各成分的分子式、保留時(shí)間（R）、質(zhì)荷比（/）及正、負(fù)離子模式等參數(shù)見表1。混合對(duì)照品溶液及補(bǔ)骨脂丸供試品溶液的HPLC圖及正、負(fù)離子模式（ESI+、ESI?）下總離子流圖（TIC）見圖1。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取蘆丁、茴香醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、反式茴香腦、異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品適量至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為1.015、2.000、1.152、1.029、1.031、1.024、1.042、1.008、0.817、2.000、1.099、1.027、2.000 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；再分別精密量取上述單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，至同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度分別為4 922.75、35 000.00、131 328.00、118 849.50、2 113.55、8 845.31、10 107.40、1 310.40、5 424.88、25 000.00、7 583.10、7 529.96、208 000.00 ng/mL的混合對(duì)照品母液；將混合對(duì)照品母液逐級(jí)稀釋，得一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，待測(cè)。

表1 13種代表性成分的檢測(cè)信息

1-蘆丁 2-茴香醛 3-補(bǔ)骨脂素 4-異補(bǔ)骨脂素 5-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮 6-新補(bǔ)骨脂異黃酮 7-補(bǔ)骨脂二氫黃酮 8-補(bǔ)骨脂寧 9-補(bǔ)骨脂定 10-反式茴香腦 11-異補(bǔ)骨脂查耳酮 12-補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚 13-補(bǔ)骨脂酚 A-13種成分的混合對(duì)照品（HPLC） B-13種成分的混合對(duì)照品（ESI+） C-13種成分的混合對(duì)照品（ESI?） D-補(bǔ)骨脂丸樣品（HPLC） E-補(bǔ)骨脂丸樣品（ESI+） F-補(bǔ)骨脂丸樣品（ESI?） G-缺補(bǔ)骨脂陰性樣品（HPLC） H-缺補(bǔ)骨脂陰性樣品（ESI+） I-缺補(bǔ)骨脂陰性樣品（ESI?） J-缺小茴香陰性樣品（HPLC） K-缺小茴香陰性樣品（ESI+） L-缺小茴香陰性樣品（ESI?）

2.4 供試品溶液的制備

將鹽補(bǔ)骨脂、鹽小茴香搗碎，過1號(hào)藥典篩。分別取鹽補(bǔ)骨脂20 g、鹽小茴香20 g組成補(bǔ)骨脂丸，精密稱定，置圓底燒瓶中，加8倍量水，浸泡30 min，回流提取30 min，濾過；再加6倍量水，回流提取30 min，濾過，合并2次濾液，稀釋至1000 mL，離心（轉(zhuǎn)速為12 000 r/min）2次，每次10 min，取上清液，即得補(bǔ)骨脂丸供試品溶液。補(bǔ)骨脂丸模擬I號(hào)、II號(hào)及III號(hào)供試品溶液的制備同上。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 取各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液、供試品溶液、缺補(bǔ)骨脂陰性供試品溶液、缺小茴香陰性供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)所述的檢測(cè)方法進(jìn)樣，13種代表性成分分離度良好，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限 將“2.2”項(xiàng)下配制的一系列混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)所述的檢測(cè)方法進(jìn)樣分析，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各指標(biāo)成分的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（），所有指標(biāo)成分均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。將混合對(duì)照品溶液進(jìn)行連續(xù)稀釋，以信噪比3∶1和10∶1來確定各指標(biāo)成分的檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表2。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得13種代表性成分蘆丁、茴香醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、反式茴香腦、異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD分別為1.12%、0.64%、0.60%、0.77%、1.13%、0.99%、0.91%、1.19%、1.02%、0.79%、1.00%、2.60%、2.89%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取模擬III號(hào)6份，精密稱定，以“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件，記錄峰面積，計(jì)算供試品溶液中13種代表性成分蘆丁、茴香醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、反式茴香腦、異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為3.36%、2.91%、1.63%、3.66%、3.10%、4.87%、4.06%、3.54%、4.39%、4.16%、4.43%、3.18%、4.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一模擬III號(hào)供試品溶液，分別在不同時(shí)間（制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h）進(jìn)樣分析，計(jì)算13種代表性成分蘆丁、茴香醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、反式茴香腦、異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD分別為2.25%、1.89%、1.04%、4.06%、4.48%、3.85%、4.55%、3.36%、4.33%、4.17%、4.66%、3.52%、2.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 13種代表性成分的回歸方程和相關(guān)參數(shù)

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已測(cè)定13種指標(biāo)成分含量的模擬品（生補(bǔ)骨脂10 g＋生小茴香10 g），平行6份，分別加入“2.2”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算得13種代表性成分蘆丁、茴香醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、反式茴香腦、異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚的平均加樣回收率分別為92.49%、105.22%、96.52%、96.32%、88.76%、91.87%、92.23%、107.89%、103.06%、105.13%、89.88%、92.69%、102.34%，RSD分別為3.50%、2.76%、1.29%、2.07%、4.60%、3.90%、3.14%、5.08%、3.27%、4.79%、4.14%、3.25%、5.34%。

2.5.7 樣品含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備補(bǔ)骨脂丸和3種模擬品供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算13種代表性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（扣除水分，以干燥品計(jì)算含量，生補(bǔ)骨脂含水量6.48%、鹽補(bǔ)骨脂含水量6.17%、生小茴香含水量6.87%、鹽小茴香含水量5.51%），結(jié)果見表3。

表3 不同樣品中13種代表性成分的含量測(cè)定 (, n = 3)

與模擬III號(hào)比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01simulants group III

2.6 補(bǔ)骨脂丸及補(bǔ)骨脂丸模擬品水煎液中代表性成分含量差異

通過SPSS 20.0軟件對(duì)補(bǔ)骨脂丸及3種補(bǔ)骨脂丸模擬品中13種代表性成分的含量結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表3。與模擬III號(hào)（由生補(bǔ)骨脂、生小茴香組成）相比，補(bǔ)骨脂丸水煎液中，異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮明顯升高（＜0.01），補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚明顯升高（＜0.05），補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、茴香醛及反式茴香腦明顯降低（＜0.01）；模擬I號(hào)水煎液中，新補(bǔ)骨脂異黃酮明顯升高（＜0.01），補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、反式茴香腦及異補(bǔ)骨脂查耳酮明顯降低（＜0.01）；模擬II號(hào)水煎液中，異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂定和茴香醛明顯降低（＜0.01），補(bǔ)骨脂二氫黃酮和反式茴香腦明顯降低（＜0.05）。其余成分各組之間無(wú)顯著性差異，但也具有一定的變化趨勢(shì)。

與3種模擬品相比，補(bǔ)骨脂丸中蘆丁、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚7個(gè)成分含量均升高，而茴香醛、反式茴香腦及補(bǔ)骨脂酚含量降低；與模擬II、III號(hào)相比，香豆素類如補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量降低。

將補(bǔ)骨脂丸及補(bǔ)骨脂丸模擬品中13種代表性成分，分別按照香豆素類、黃酮類及揮發(fā)油類進(jìn)行分類，并比較不同類型成分含量變化。與3種模擬品相比，補(bǔ)骨脂丸水煎液中香豆素類和揮發(fā)油類成分煎出減少，黃酮類成分煎出增加。與模擬III號(hào)相比，模擬I號(hào)和II號(hào)呈現(xiàn)共同趨勢(shì)：黃酮類、香豆素類和揮發(fā)油類成分煎出均減少。

2.7 化學(xué)成分與止瀉藥效相關(guān)性分析

2.7.1 指標(biāo)水平檢測(cè) 鹽炙對(duì)補(bǔ)骨脂丸成分煎出的影響，最終表現(xiàn)為藥理作用差異。課題組前期已建立脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠模型，探討了補(bǔ)骨脂丸和3種補(bǔ)骨脂丸模擬品對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂丸溫腎助陽(yáng)、暖脾止瀉的作用優(yōu)于3種補(bǔ)骨脂丸模擬品，本實(shí)驗(yàn)造模、分組、給藥參照已發(fā)表文獻(xiàn)方法[7]。取雄性SD大鼠（共117只，造模過程中死亡16只，剩余101只）適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為9組，分別為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥參苓白術(shù)丸組、鹽補(bǔ)骨脂組、生補(bǔ)骨脂組、補(bǔ)骨脂丸組及模擬補(bǔ)骨脂丸I～I(xiàn)II組。除對(duì)照組外，其他各組大鼠每天上午ig給予氫化可的松注射液（15 mg/kg），連續(xù)14 d致腎陽(yáng)虛，從第15天開始每天上午ig冰番瀉葉水煎液（10 g/kg），連續(xù)14 d，致脾陽(yáng)虛瀉下。除對(duì)照組和模型組外，其余各給藥組從第15天開始，每天下午ig給藥，陽(yáng)性藥組給予參苓白術(shù)丸混懸液（2 g/kg），鹽補(bǔ)骨脂組、生補(bǔ)骨脂組、補(bǔ)骨脂丸組及模擬補(bǔ)骨脂丸I～I(xiàn)II組按生藥劑量8 g/kg給藥，連續(xù)給藥14 d，對(duì)照組和模型組給予同等體積生理鹽水。

胃腸激素中胃泌素促進(jìn)胃酸和胃蛋白酶的分泌，并促進(jìn)消化道黏膜生長(zhǎng)及胃腸道平滑肌收縮，脾虛泄瀉使胃腸運(yùn)動(dòng)加劇，胃泌素水平偏高[8]；氫化可的松為外源性糖皮質(zhì)激素，可通過抑制垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，而減少腎上腺酮的分泌，同時(shí)促進(jìn)蛋白質(zhì)分解、加快能量代謝，造成機(jī)體“耗竭”，繼而誘發(fā)腎陽(yáng)虛癥狀。藥效學(xué)指標(biāo)選用胃腸激素和下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)指標(biāo)胃泌素、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）、腎上腺酮進(jìn)行測(cè)定，各組大鼠血清中指標(biāo)水平測(cè)定結(jié)果見表4。

本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)分析法[9-10]，對(duì)補(bǔ)骨脂丸及3種補(bǔ)骨脂丸模擬品中代表性成分和止瀉藥效指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，探討化學(xué)成分與止瀉作用的貢獻(xiàn)度，以探討鹽炙增效機(jī)制。

表4 補(bǔ)骨脂丸及補(bǔ)骨脂丸模擬品大鼠血清胃泌素、ACTH、腎上腺酮水平(, n = 10)

2.7.2 原始數(shù)據(jù)的處理 以胃泌素、ACTH、腎上腺酮數(shù)據(jù)作為參考數(shù)列，以代表性成分的含量作為比較數(shù)列，采用均值化方法變換原始數(shù)據(jù)，得到均值化處理數(shù)列。

2.7.3 絕對(duì)差序列及關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 經(jīng)數(shù)據(jù)變換的比較數(shù)列記為Y()，參考數(shù)列記為o()，計(jì)算各比較數(shù)列與參考數(shù)列的絕對(duì)差，稱為絕對(duì)差序列，即Δoi()＝|o(m)－Y(m)|。

求比較數(shù)列｛Y()｝與參考數(shù)列｛o()｝的關(guān)聯(lián)系數(shù)（oi），分辨系數(shù)＝0.5（0＜＜1，一般取0.5），其計(jì)算公式為oi＝[Δmax＋Δmin]/[Δmax＋Δoi()]。

2.7.4 關(guān)聯(lián)度 關(guān)聯(lián)度為各成分關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值，結(jié)果見表5。補(bǔ)骨脂丸及3種補(bǔ)骨脂丸模擬品中，與止瀉作用相關(guān)指標(biāo)胃泌素關(guān)聯(lián)度較高的成分為茴香醛＞補(bǔ)骨脂酚（關(guān)聯(lián)度＞0.7）；與ACTH關(guān)聯(lián)度較高的成分為新補(bǔ)骨脂異黃酮＞補(bǔ)骨脂二氫黃酮＞補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚＞補(bǔ)骨脂寧＞補(bǔ)骨脂定＞異補(bǔ)骨脂二氫黃酮（關(guān)聯(lián)度＞0.7）；與腎上腺酮關(guān)聯(lián)度較高的成分為異補(bǔ)骨脂二氫黃酮＞補(bǔ)骨脂寧＞蘆丁＞補(bǔ)骨脂酚＞補(bǔ)骨脂二氫黃酮＞新補(bǔ)骨脂異黃酮＞茴香醛＞補(bǔ)骨脂定（關(guān)聯(lián)度＞0.7）?？傮w上，補(bǔ)骨脂丸及3種補(bǔ)骨脂丸模擬品的止瀉作用與黃酮類成分相關(guān)性較高，與香豆素類相關(guān)性較低。

3 討論

補(bǔ)骨脂丸與3種補(bǔ)骨脂丸模擬品相比，香豆素類和揮發(fā)油類成分含量降低，而黃酮類成分含量升高。模擬I、II號(hào)與模擬III號(hào)相比，黃酮類、香豆素類和揮發(fā)油類成分煎出均減少。因此，補(bǔ)骨脂和小茴香鹽炙后組成補(bǔ)骨脂丸，可促進(jìn)復(fù)方中黃酮類成分的煎出，抑制香豆素類和揮發(fā)油類成分的煎出。

表5 13種代表性成分含量與止瀉藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果

鹽炙促進(jìn)黃酮類成分煎出。相比其他模擬品，補(bǔ)骨脂丸水煎液中黃酮類成分含量升高，可能原因是①鹽炙過程中的“殺酶保苷”，使苷類成分更好的保留；②補(bǔ)骨脂中的磷脂類成分和小茴香中的脂肪酸類成分都屬于表面活性劑，可形成單個(gè)膠束或磷脂-脂肪酸混合膠束。2種以上表面活性劑締合而成的混合膠束，具有更低的臨界膠束濃度，更好的穩(wěn)定性[11-12]。而無(wú)機(jī)鹽的存在，一是能降低表面活性劑臨界膠束濃度[13-14]，使其更易形成膠束，增大膠束直徑；二是能降低離子頭相互排斥作用，使更多表面活性劑離子進(jìn)入膠團(tuán)中，疏水端更集中，提高膠束締合數(shù)量，增加增溶空間[15-16]。黃酮類成分與膠束親和性更強(qiáng)，這可能是鹽炙后黃酮類成分含量升高的原因。

鹽炙抑制香豆素類成分煎出。與模擬III號(hào)相比，補(bǔ)骨脂丸和模擬I號(hào)的水煎液中香豆素類成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量均明顯降低，其原因可能為：①鹽炙主要包括鹽水悶潤(rùn)和炒制兩個(gè)過程，在鹽水悶潤(rùn)時(shí)，補(bǔ)骨脂處在低溫、濕潤(rùn)的環(huán)境中，補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷被酶解為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素；在炒制的過程中，酶在高溫作用下失去活性，而“熱因素”大于“鹽或水因素”，使苷類成分更好的保留，從而苷元成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量下降[17]；②補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為呋喃香豆素類化合物，鹽炙過程中的高溫可能致其開環(huán)而含量降低[18]；③表面活性劑可以形成具有增溶作用的膠束，但不同的化合物在同一膠束體系中存在競(jìng)爭(zhēng)性，致使同一體系中，與疏水端極性相近的物質(zhì)會(huì)占領(lǐng)更多的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制極性更大或極性更小的物質(zhì)與膠束結(jié)合。黃酮類成分較香豆素類成分可能占據(jù)了更多結(jié)合位點(diǎn)，使香豆素類成分含量降低?；谝陨?大方面因素的影響，補(bǔ)骨脂鹽炙后與小茴香配伍，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量降低。

鹽炙抑制揮發(fā)油類成分煎出。與補(bǔ)骨脂丸模擬品相比，補(bǔ)骨脂丸中揮發(fā)性成分補(bǔ)骨脂酚、茴香醛和反式茴香腦的含量降低，可能與鹽炙過程中高溫降低揮發(fā)油含量，及不同成分競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合膠束能力不同有關(guān)，從而影響揮發(fā)油類成分的煎出。

研究證明，蘆丁具有一定的止瀉作用[19-20]，新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等成分止瀉藥效貢獻(xiàn)率較高[21]，這與本實(shí)驗(yàn)灰色關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果基本一致。補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂肝腎毒性的來源之一[22-24]，小茴香中以反式茴香腦和茴香醛等為主的揮發(fā)油類成分具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)的作用[25-26]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，黃酮類成分與止瀉藥效相關(guān)度較高，揮發(fā)油類成分次之，香豆素類成分中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素與止瀉藥效相關(guān)性較低。鹽炙后配伍組成補(bǔ)骨脂丸，促進(jìn)黃酮類成分煎出，抑制揮發(fā)油類成分煎出，可能是鹽炙后止瀉作用增強(qiáng)的主要原因之一。

鹽炙炮制目的主要體現(xiàn)在增效和緩燥，補(bǔ)骨脂“性本大燥毒”，鹽炙可緩和其燥性。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素作為補(bǔ)骨脂的主要成分，鹽炙后體外溶出降低，但與止瀉作用關(guān)聯(lián)度較小，這是否與鹽炙緩和燥毒有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。此外炮制增效不僅與化學(xué)成分體外溶出相關(guān)，還與化學(xué)成分體內(nèi)過程有關(guān)，課題組將繼續(xù)研究補(bǔ)骨脂丸中成分體內(nèi)過程，以進(jìn)一步豐富中藥鹽炙炮制機(jī)制科學(xué)內(nèi)涵。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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To explore synergistic mechanism of Buguzhi Pills based on correlation between antidiarrheal effect and difference of ingredients before and after salt processing

WU Qi-tong1, WANG Jin-jin1, YANG An-nan1, ZHOU Ning1, 2, ZHAO Qiang3, LI Kai1, 2, ZHANG Zhen-ling1, 2

1. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Research Center for Special Processing Technology of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 3. Center for Evaluation and Inspection of Hubei Medical Products Administration, Wuhan 430071, China

To explore the influence of salt processing on the representative decoction components of Buguzhi Pills (補(bǔ)骨脂丸), and the correlation between the components and the antidiarrhea effect.HPLC-MS was used to determine the differences of 13 representative components in decoction of Buguzhi Pills and three simulants of Buguzhi Pills. Combined with the different experimental groups’ results on spleen-kidneydeficiency diarrhea model rats about their gastrointestinal hormone and related indexes of hypothalamus-pituitary-adrenal axis, then gray correlation analysis method was used to analyze the correlation between the ingredients and the antidiarrhea effects to determine major contributors in efficacy.Compared with the three simulants, the decoction of Buguzhi pills was higher in flavonoids such as rutinum, isobavachin, neobavaisoflavone, bavachin, corylin, isobavachalcone and bavachinin, while it was lower in volatile oils, for instance, anisaldehyde, trans-anethol and bakuchiol. Moreover, compared with the group II and III, it was lower in coumarins like psoralen and isopsoralen. And the ingredients vary in the antidiarrhea efficacy: The flavonoid and volatile oil were highly correlated with the antidiarrhea efficacy, whereas the coumarin (such as psoralen and isopsoralen) had a low correlation.After salt processing,andformed Buguzhi Pills, which can promote the dissolution of flavonoids and inhibit the dissolution of volatile oils and coumarins, this may be one of the key processes in salt processing to enhance the antidiarrhea effect.

Buguzhi Pills;;; salt processing; compatibility of medicines; antidiarrheal; HPLC-MS; spleen-kidneydeficiency; gray correlation analysis; flavonoids; coumarin; volatile oils

R283.1

A

0253 - 2670(2021)21 - 6493 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.006

2021-06-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81873005）；河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（21HASTIT047）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃（2018GGJS083）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810471002）

毋啟桐（1997—），女，碩士研究生，主要從事中藥炮制物質(zhì)基礎(chǔ)及炮制機(jī)制研究。E-mail: 1106766001@qq.com

李 凱，男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥炮制研究。Tel: (0371)65962746 E-mail: cpulikai@163.com

張振凌，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥炮制研究。Tel: (0371)65962746 E-mail: zhangzl6758@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]