多庫酯鈉與人血清蛋白的非共價相互作用

杜 超，林榮坤，杭 緯

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，它們可以結(jié)合多種類型的配體，如脂肪酸、金屬離子、藥物和表面活性劑等.其中，蛋白質(zhì)-表面活性劑復(fù)合物不僅在化妝品研發(fā)、食品安全以及藥物在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)等領(lǐng)域中有著重要的應(yīng)用，而且它還可以模擬人體內(nèi)的生物系統(tǒng).多庫酯鈉(docusate sodium，DSS)不僅被廣泛地用作食品添加劑、藥物中間體、有機(jī)溶劑等，還可以作為藥物治療慢性便秘[1].此外，DSS是一種硫酸化表面活性劑，可以通過破壞病毒包膜和使蛋白質(zhì)變性來滅活單純皰疹病毒，從而防止性傳播感染[2].人血清蛋白(human serum albumin，HSA)是人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的主要蛋白質(zhì)成分.HSA含有大量可電離的氨基酸因而具有相對較高的水溶性.HSA不僅可以作為藥物分子的載體，還可以維持正常的血壓和結(jié)合許多不同類型的兩性分子，其形態(tài)在活細(xì)胞中可調(diào)節(jié)特定的細(xì)胞功能.因此，研究DSS和HSA之間的非共價相互作用具有非常重要的實(shí)際意義.

過去研究的小分子僅局限于藥物或表面活性劑中的一類性質(zhì)，而同時具備藥物和表面活性劑性質(zhì)的小分子尚未被報(bào)道過[3].分析蛋白質(zhì)與小分子之間非共價相互作用的最常用方法是光譜法，其具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、獲取信息豐富等優(yōu)點(diǎn)，但不能提供蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量比關(guān)系[4-5].作為一種軟電離源，電噴霧電離可以保持蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的完整性，并具有直接測量蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物化學(xué)計(jì)量比的優(yōu)勢.因此，本研究通過電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)結(jié)合熒光光譜、紫外-可見吸收光譜和圓二色譜(circular dichroism,CD)系統(tǒng)地分析了DSS與HSA之間相互作用的化學(xué)計(jì)量比、結(jié)合常數(shù)、作用力類型以及DSS對HSA二級結(jié)構(gòu)的影響，以期為闡明DSS在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及進(jìn)一步研究其相關(guān)活性功能奠定基礎(chǔ)，并在分子水平上為理解表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理提供理論參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(Micro Q-TOF impact Ⅱ，德國布魯克公司),熒光分光光度計(jì)(F-7000，日本日立公司),紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2550，日本島津公司),多功能手性光譜儀(MOS-500，法國Bio-Logic公司)；HSA(純度大于99%，北京謹(jǐn)明生物科技有限公司)，DSS(純度99%，成都化夏化學(xué)試劑有限公司)，乙酸銨(NH4Ac，純度99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ESI-MS

取1.0 mL 100 μmol/L的HSA溶液于10 mL比色管中，分別加入不同體積的100 μmol/L DSS溶液，再用10 mmol/L的NH4Ac緩沖溶液(pH 7.0)定容到10 mL(HSA的最終濃度為10 μmol/L)，并在37 ℃下水浴反應(yīng)30 min.分別將待測溶液通過注射泵以3.0 μL/min 的速率注入到ESI-MS儀中，并采集質(zhì)荷比范圍為800～3 500的質(zhì)譜信號.正離子模式下的最佳測試條件為：毛細(xì)管電壓-3.5 kV，霧化器壓力40 kPa，脫溶劑氣流速率4 L/min，去溶劑溫度180 ℃.

1.2.2 熒光光譜

取2.0 mL 10 μmol/L的HSA溶液于10 mL比色管中，分別加入不同體積的100 μmol/L DSS溶液，再用10 mmol/L的NH4Ac緩沖溶液(pH 7.0)定容到10 mL(HSA的最終濃度為2.0 μmol/L)，并分別在25，35和45 ℃下避光水浴反應(yīng)30 min后，立即進(jìn)行熒光測量.測試條件為：激發(fā)波長為295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，光電倍增管的工作電壓為700 V，熒光發(fā)射光譜收集的范圍為300～460 nm.

1.2.3 紫外-可見吸收光譜

將1.0 μmol/L的HSA以及含有不同濃度的DSS的反應(yīng)混合溶液，分別以NH4Ac緩沖溶液為參比進(jìn)行分析.測試條件為：石英池厚度1.0 cm，狹縫寬度2.0 nm，掃描范圍200～350 nm.

1.2.4 CD

將1.0 μmol/L的HSA以及含有不同濃度的DSS的反應(yīng)混合溶液分別進(jìn)行測試.測定條件為：石英樣品池光程0.3 cm，掃描速度200 nm/min，掃描范圍200～250 nm.最終采集的CD譜圖為25 ℃下扣除溶液空白背景的3次掃描所取得的平均結(jié)果.HSA的二級結(jié)構(gòu)分析使用儀器自帶的Dicroprot軟件進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 ESI-MS分析

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)-配體復(fù)合物通過軟電離源被離子化時，其非共價結(jié)構(gòu)可以在氣相中得以保持[6].因此，ESI-MS可用于研究小分子與蛋白質(zhì)的非共價相互作用.濃度為10 μmol/L的HSA在10 mmol/L的NH4Ac緩沖溶液中的ESI-MS譜圖如圖1(a)所示.此時測得HSA的分子質(zhì)量為66.54 ku,與理論值一致；并選取HSA中4個較強(qiáng)的多電荷質(zhì)譜峰(37+～40+)進(jìn)行DSS與HSA的相互作用分析.HSA與DSS摩爾比為1∶1時的ESI-MS譜圖如圖1(b)所示,可以發(fā)現(xiàn)4個多電荷質(zhì)譜峰發(fā)生了偏移，這是因?yàn)镈SS結(jié)合到HSA上，形成了HSA-DSS復(fù)合物，分子質(zhì)量增加，所以導(dǎo)致質(zhì)荷比m/z發(fā)生了偏移[7].

P和L分別表示蛋白質(zhì)HSA和配體DSS，下同.

在ESI-MS譜圖中，質(zhì)譜峰的電荷數(shù)和結(jié)合的配體個數(shù)遵循方程[7]：m/z=(mHSA+jmDSS+imH)/i，其中mHSA和mDSS分別為蛋白質(zhì)HSA和配體DSS的分子質(zhì)量，j為HSA上結(jié)合的DSS分子數(shù)，mH為H原子的質(zhì)量，i為HSA在電噴霧過程中所帶的電荷數(shù).HSA與DSS摩爾比為1∶3時的ESI-MS譜圖如圖2(a)所示.此時ESI-MS的去卷積結(jié)果表明，多電荷質(zhì)譜峰(40+)中P+L的質(zhì)荷比與前后兩個質(zhì)譜峰(P與P+2L)之間的質(zhì)荷比差值分別為10.53 和10.51，它們與電荷數(shù)(40+)的乘積為HSA上結(jié)合的DSS的分子質(zhì)量.HSA與DSS摩爾比為1∶6 時的ESI-MS譜圖如圖2(b)所示，此時檢測到每個HSA分子上最多可以結(jié)合3個DSS分子.在較高的DSS濃度下(HSA與DSS摩爾比為1∶8時)，檢測到每個HSA分子上結(jié)合的DSS分子數(shù)不會繼續(xù)增加.此外，隨著DSS濃度不斷增加,蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的質(zhì)譜峰不斷偏離基線，且強(qiáng)度不斷下降，這是因?yàn)镈SS作為陰離子表面活性劑會嚴(yán)重抑制蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的信號[8].ESI-MS結(jié)果表明DSS與HSA兩者之間形成了穩(wěn)定的HSA-DSS復(fù)合物，并且在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下這種結(jié)合可以在氣相中得以維持[9].

圖2 HSA與DSS摩爾比分別為1∶3(a)和1∶6(b)時的ESI-MS譜圖

2.2 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光，主要是由色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基所致，其中，Trp是主要的內(nèi)源熒光源，并且對局部環(huán)境高度敏感.在HSA中僅包含一個Trp殘基，即蛋白質(zhì)內(nèi)部的Trp214.可以使用295 nm的激發(fā)波長來消除Tyr和Phe的熒光干擾，以獲取有關(guān)Trp殘基的信息[10].不同DSS濃度下的HSA熒光發(fā)射光譜如圖3所示，可以發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度隨DSS濃度的增加而增強(qiáng)，同時還伴隨著最大發(fā)射波長從334.4 nm藍(lán)移到313.2 nm，并且藍(lán)移程度隨著DSS濃度的增加而增強(qiáng)，然后在高濃度下達(dá)到恒定.這種熒光增強(qiáng)現(xiàn)象稱為熒光增敏作用，通常在生物大分子與某些配體共存時發(fā)生[11]；而最大發(fā)射波長藍(lán)移表明DSS的加入使得HSA中的Trp殘基周圍微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，極性降低，從而導(dǎo)致HSA腔內(nèi)疏水結(jié)構(gòu)變得更緊密，肽鏈伸展程度減小，因此推測HSA的構(gòu)象發(fā)生了改變；此外藍(lán)移還體現(xiàn)了HSA從天然蛋白質(zhì)分子向HSA-DSS復(fù)合物轉(zhuǎn)移的程度；最大發(fā)射波長值恒定不變表明DSS不再與HSA發(fā)生結(jié)合[12].

HSA濃度為2.0 μmol/L，a到k對應(yīng)的DSS濃度分別為0,2,4,6,8,10,12,15,20,25,30 μmol/L.

熒光增強(qiáng)遵循方程[13]:1/(F-F0)=1/ΔFmax+1/(KcDSSΔFmax)，其中，F(xiàn)為加入DSS后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為未加入DSS時的熒光強(qiáng)度，ΔFmax=F∞-F0(F∞為HSA與DSS相互作用達(dá)到飽和時的熒光強(qiáng)度)，K為HSA與DSS的結(jié)合常數(shù)，cDSS為DSS的濃度.圖4(a)顯示了不同溫度(25，35和45 ℃)下的方程擬合曲線，從曲線的斜率和截距可以計(jì)算出不同溫度下HSA與DSS的結(jié)合常數(shù)，相關(guān)結(jié)果列于表1.從表1可知，HSA與DSS的結(jié)合常數(shù)K>105L/mol，表明二者之間具有很強(qiáng)的結(jié)合力；并且HSA-DSS復(fù)合物的穩(wěn)定性隨著溫度升高而降低.

表1 不同溫度下HSA-DSS體系的結(jié)合常數(shù)以及相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)

通常，蛋白質(zhì)與小分子之間相互結(jié)合的非共價作用力包括范德華力、靜電作用力、氫鍵和疏水作用力.為了確定HSA和DSS之間的作用力類型，需要計(jì)算HSA與DSS反應(yīng)的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，例如焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG).ΔS和ΔH遵循vant’Hoff方程[14]：lnK=-ΔH/RT+ΔS/R，其中R為氣體常數(shù)，其方程擬合曲線如圖4(b)所示，計(jì)算得ΔH=-16.62 kJ/mol,ΔS=46.58 J/(mol·K).ΔG遵循方程：ΔG=ΔH-TΔS.ΔG和ΔH均小于零，表明HSA-DSS復(fù)合物的形成是一個自發(fā)的放熱過程.根據(jù)Ross等[15]和Subramanian等[16]研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用時總結(jié)的規(guī)律可知，ΔS大于零時,可作為疏水作用力的標(biāo)志；ΔS與ΔH均小于零時，可作為氫鍵和范德華力的標(biāo)志；ΔS大于零且ΔH小于零時為水溶液中離子之間的特定靜電相互作用的特征.在HSA中具有兩個相反類型(即疏水基團(tuán)和極性基團(tuán))的主要結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合多種類型的化合物[17].第一個結(jié)合位點(diǎn)“Sudlow’s Site Ⅰ”位于子域ⅡA中，可以形成由帶正電荷的氨基酸殘基所包圍的疏水腔，并且Trp214殘基就位于其中；第二個結(jié)合位點(diǎn)“Sudlow’s Site Ⅱ”位于子域ⅢA中，比第一個結(jié)合位點(diǎn)要小.DSS具有兩條疏水鏈，可以為HSA提供較強(qiáng)的疏水性環(huán)境，并且DSS在水溶液中完全電離.綜上所述，判斷DSS可以通過疏水作用力和靜電作用力結(jié)合到HSA子域ⅡA的疏水口袋內(nèi)[7,17].

圖4 不同溫度下1/(F-F0)對cDSS-1(a)和ln K對T-1(b)的擬合曲線

2.3 紫外-可見吸收光譜分析

不同DSS濃度下的紫外-可見吸收光譜如圖5所示.由于蛋白質(zhì)骨架的π-π*躍遷，HSA在200～230 nm處有一個很強(qiáng)的吸收峰,并且在280 nm左右出現(xiàn)一個較弱的特征吸收帶，這是由氨基酸殘基(Trp、Tyr和Phe)的n-π*躍遷引起的[10].Trp和Tyr殘基的吸光度取決于其發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境，它們向波長范圍的任一側(cè)移動(即紅移或藍(lán)移)取決于周圍環(huán)境的極性[18].加入DSS后，HSA的吸光度顯著提高，發(fā)生明顯的增色效應(yīng)，同時最大吸收波長值出現(xiàn)輕微的藍(lán)移.這是由于圍繞蛋白質(zhì)殘基的極性增加，蛋白質(zhì)的肽鏈延伸得更多，從而導(dǎo)致HSA的二級結(jié)構(gòu)和周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化[19].紫外-可見吸收光譜結(jié)果表明HSA與DSS發(fā)生了相互作用，并形成了穩(wěn)定的基態(tài)復(fù)合物.

圖5 不同DSS濃度下HSA的紫外-可見吸收光譜

2.4 CD分析

圖6顯示了不同DSS濃度下HSA的CD譜圖.由于肽鍵的π-π*和n-π*躍遷，HSA的CD譜圖出現(xiàn)兩個負(fù)吸收帶，分別位于209和222 nm附近的紫外區(qū)域，它們是蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征.在不存在DSS時，HSA的α-螺旋含量為49.9%，該結(jié)果與文獻(xiàn)值(50.5%)[20]基本一致.隨著DSS的濃度不斷增加，α-螺旋含量從49.9%上升至55.5%.這是由于DSS分子為HSA提供了較強(qiáng)的疏水性環(huán)境，增強(qiáng)了HSA和DSS之間的疏水作用力，從而導(dǎo)致HSA的α-螺旋含量增加[21].上述結(jié)果進(jìn)一步證明DSS破壞了HSA的二級結(jié)構(gòu).

圖6 不同DSS濃度下HSA的CD譜圖

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用質(zhì)譜法和光譜法詳細(xì)地闡釋了DSS與HSA之間的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)DSS對HSA的影響是多方面的.ESI-MS結(jié)果表明HSA與DSS之間可以形成化學(xué)計(jì)量比為1∶3的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物.熒光光譜分析表明DSS對于HSA的內(nèi)源熒光有增強(qiáng)作用，并造成熒光最大發(fā)射波長從334.4 nm藍(lán)移到313.2 nm，證明DSS的存在可以使HSA中Trp殘基周圍的極性降低，疏水性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更為緊密；根據(jù)Ross定律判斷DSS可以通過疏水作用力和靜電作用力結(jié)合到HSA的子域ⅡA中的疏水口袋內(nèi).紫外-可見吸收光譜表明DSS存在時，HSA吸收峰的強(qiáng)度表現(xiàn)為明顯的增色效應(yīng)且最大吸收波長產(chǎn)生藍(lán)移現(xiàn)象，進(jìn)一步證明DSS與HSA之間形成了基態(tài)復(fù)合物.CD分析結(jié)果表明隨著DSS濃度增大，HSA的負(fù)峰吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，即α-螺旋的含量增加，進(jìn)一步證明DSS與HSA相互作用后導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化.