天麻舒心方通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌通路干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠心臟舒張功能的機(jī)制研究

潘立敏，徐貴成，劉 坤，王 卉，單雅蒙，王 洋

全球疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)告顯示，心血管疾病仍是最主要的死因[1]。高血壓不僅是一種以動(dòng)脈血壓升高為主要表現(xiàn)的疾病，而且是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。而左心室肥厚是其最常見(jiàn)的心臟損害，早期主要表現(xiàn)為舒張功能不全，可逐漸發(fā)展至舒張性心力衰竭、收縮性心力衰竭，甚至全心衰竭。天麻舒心方具有平肝益腎、滋陰潛陽(yáng)、活血通絡(luò)之功效，具有明確的降壓作用，且對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左室舒張功能損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)可改善高血壓心肌超微結(jié)構(gòu)損傷[2-10]。本研究擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探尋天麻舒心方改善SHR受損的左心室舒張功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SHR 50只，Wistar雄性大鼠10只，鼠齡14周；動(dòng)物級(jí)別：二級(jí)，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，購(gòu)置后于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，該中心環(huán)境設(shè)施符合二級(jí)動(dòng)物(清潔動(dòng)CL)標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物室內(nèi)溫度18～22 ℃；濕度50%～60%；光照和通風(fēng)條件均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 天麻舒心浸膏液，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑室生產(chǎn)；氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：H20030654，研磨后用無(wú)菌蒸餾水配制成混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：BP-6)，125I試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)，r-911 全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司提供，檢測(cè)單位：北京華英生物技術(shù)研究所)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 儀(Long Gene MyGene MG96+)，熒光定量 PCR 儀(Line-Gene K)，凝膠成像系統(tǒng)(GelOcumentuteon Systern Beosens SC 805)，低溫冷凍離心機(jī)(Thermo Fresco21)，酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan MK3)，電泳槽(Cavoy Mini P-4)，濕轉(zhuǎn)電泳槽(Tanon VE186)，電泳儀(北京六一 DYY-7C)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 50只SHR按體質(zhì)量、血壓水平分層后隨機(jī)分為5組，其中天麻舒心方高、中、低劑量組分別給予天麻舒心浸膏液每天11.592 g/kg、5.796 g/kg、2.898 g/kg，分別相當(dāng)于成人用生藥量的28倍、14倍、7倍；西藥對(duì)照組給予氯沙坦鉀混懸液每天17.5 mg/kg；模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水。10只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組，給予同體積蒸餾水。各組灌胃給藥，每日1次，共18周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 SHR血漿及心肌血管緊張素(Ang)Ⅱ、Ang(1-7)含量 給藥18周后，麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL，迅速注入冰水浴冷卻的酶抑制劑抗凝管中，搖勻，即刻放回冰水浴中冷卻，1 000 r/min離心5 min，分離血漿。處死大鼠后開(kāi)胸，速取心臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干，沿房室溝剪掉兩心房，剪掉主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈，緊貼室間隔右側(cè)剪掉右心室游離壁，剩余為左心室，取心室肌并勻漿。125I放射免疫分析法測(cè)定血漿及心肌組織的AngⅡ及Ang(1-7)水平。

1.5.2 SHR心肌血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、ACE2及Ang(1-7)受體(Mas)的mRNA表達(dá) 取材方法如前，取-80 ℃冰箱保存的大鼠心肌組織100 mg，Trizol一步法提取心肌組織總RNA，比色法測(cè)定總RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)各組mRNA表達(dá)強(qiáng)度。各基因PCR擴(kuò)增引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.5.3 SHR心肌ACE、ACE2及pERK1/2蛋白表達(dá) 如取心肌組織，提取蛋白，用蛋白定量(BCA)法測(cè)蛋白濃度，經(jīng)聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液封閉。用5%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育1 h，4 ℃過(guò)夜，洗膜，二抗孵育。ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光10 s至5 min(曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整)，顯影2 min，定影。凝膠圖像分析系統(tǒng)照相和條帶密度掃描，按相對(duì)系數(shù)=目的帶表達(dá)強(qiáng)度/β-actin表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算目的蛋白表達(dá)相對(duì)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組血漿及心肌AngⅡ、Ang(1-7)含量比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血漿AngⅡ水平、心肌AngⅡ水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，西藥對(duì)照組、天麻舒心方高劑量組、天麻舒心方中劑量組、天麻舒心方低劑量組血漿AngⅡ水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，天麻舒心方低劑量組心肌AngⅡ水平明顯降低(P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血漿及心肌Ang(1-7)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，天麻舒心方高劑量組、天麻舒心方中劑量組血漿Ang(1-7)含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，西藥對(duì)照組、天麻舒心方高劑量組、天麻舒心方中劑量組、天麻舒心方低劑量組心肌Ang(1-7)含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表2、表3。

表2 各組血漿、心肌AngⅡ含量比較(±s)

表3 各組血漿、心肌Ang(1-7)含量比較(±s)

2.2 各組心肌ACE、ACE2及Mas的mRNA表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組ACE mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，ACE2 mRNA、Mas mRNA均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，天麻舒心方中劑量組、低劑量組ACE mRNA水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，西藥對(duì)照組、天麻舒心方高劑量組、天麻舒心方中劑量組ACE2 mRNA表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。西藥對(duì)照組與天麻舒心方高劑量組Mas mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組心肌ACE、ACE2及Mas的mRNA表達(dá)比較(±s)

2.3 各組SHR心肌ACE、ACE2及pERK1/2蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組ACE蛋白表達(dá)、pERK1/2蛋白表達(dá)明顯增加，ACE2蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，西藥對(duì)照組、天麻舒心方高劑量組、天麻舒心方中劑量組、天麻舒心方低劑量組ACE蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；天麻舒心方中劑量組ACE2蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。西藥對(duì)照組、天麻舒心方高劑量組、天麻舒心方中劑量組、天麻舒心方低劑量組pERK1/2蛋白表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表5、圖1。

表5 各組心肌ACE、ACE2及pERK1/2蛋白表達(dá)比較(±s)

圖1 各組心肌組織ACE、ACE2、pERK1/2蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

天麻舒心方由天麻、水蛭、赤芍、牛膝等藥物組成，具有平肝益腎、滋陰潛陽(yáng)、活血通絡(luò)之功效，適用于高血壓陰虛陽(yáng)亢、血瘀絡(luò)阻證者。早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，天麻舒心方具有明確的降壓作用，可逆轉(zhuǎn)二腎一夾型高血壓大鼠及SHR左室肥厚，降低AngⅡ，初步認(rèn)為其作用與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的抑制有關(guān)[2-8]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，服用天麻舒心方4～6個(gè)月，血壓平均降低9/7 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，并對(duì)血漿腎素、AngⅠ、AngⅡ、醛固酮、內(nèi)皮素等具有不同程度的改善[4]。研究發(fā)現(xiàn)，天麻舒心方對(duì)SHR的頸動(dòng)脈重構(gòu)及阻力血管的富營(yíng)養(yǎng)重塑具有干預(yù)作用[5-8]。新近的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，SHR模型對(duì)照組左室舒張末壓(LVEDP)明顯上升(P<0.01)，左室壓力最大下降速度(-dp/dtmax)絕對(duì)值明顯下降(P<0.01)，應(yīng)用天麻舒心方干預(yù)18周后，各劑量組LVEDP下降，-dp/dtmax絕對(duì)值上升，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)受損，表現(xiàn)為心肌肌絲多處斷裂、溶解，排列扭曲，粗細(xì)不等，線粒體腫脹、變形、聚集，嵴模糊排列混亂，西藥組及天麻舒心方各劑量組對(duì)大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善作用[9-10]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要組成部分。研究證實(shí)，RAS存在兩條相互拮抗的通路，即ACE-AngⅡ-AT1受體通路(Angiotensin converting enzyme-AngiotensinⅡ AT1)和ACE2-Ang(1-7)-Mas受體通路[Angiotensin converting enzyme 2-Angiotensin(1-7)-Mas]。前者主要通過(guò)AngⅡ引起血管收縮、血壓升高、促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增生等效應(yīng)，后者則通過(guò)對(duì)前者的拮抗，達(dá)到保護(hù)心血管的作用。ACE2作為ACE的同源物，其主要生物學(xué)效應(yīng)是在內(nèi)皮細(xì)胞中降解AngⅡ，產(chǎn)生Ang(1-7)[11-13]。Ang(1-7)是RAS中重要的活性七肽，與特異性受體Mas相結(jié)合，一方面通過(guò)拮抗 AngⅡ誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子-1 (VCAM-1)的表達(dá)，以減少核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的核轉(zhuǎn)位，減少單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并遷入內(nèi)皮攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，從而達(dá)到抗細(xì)胞增殖的作用；另一方面，通過(guò)活化 Mas-PI3K-NOS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使一氧化氮(NO)生成明顯增加，發(fā)揮擴(kuò)張血管的作用[14-15]。由此可見(jiàn)，ACE2作為RAS的內(nèi)源性調(diào)節(jié)酶，在調(diào)節(jié)RAS兩軸間的平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ACE-AngⅡ-AT1兩軸系統(tǒng)的平衡主要集中于Ang(1-7)與AngⅡ的濃度平衡上，維持AngⅡ和Ang(1-7)之間的平衡是控制血壓的關(guān)鍵[16]。

本研究結(jié)果顯示，SHR整體及心肌局部的Ang(1-7)水平均明顯降低，提示Ang(1-7)降低可能是SHR血壓升高、左心室肥厚及舒張功能損傷的病理機(jī)制之一。經(jīng)藥物干預(yù)后，整體及局部的Ang(1-7)水平增高，提示天麻舒心方可能通過(guò)增加整體及心肌Ang(1-7)表達(dá)而發(fā)揮其降低血壓、改善高血壓心室肥厚及降低高血壓左心室舒張功能損傷的作用。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組SHR心肌組織ACE mRNA表達(dá)明顯升高，而ACE2、Mas mRNA表達(dá)明顯降低，提示ACE合成增多、ACE2及Mas合成減少可能是高血壓左心室舒張功能損傷的病理機(jī)制之一，而前兩者的病理改變進(jìn)一步提示高血壓心肌損傷時(shí)存在ACE-AngⅡ-AT1和ACE2-Ang(1-7)-Mas受體通路的失衡。中藥可以逆轉(zhuǎn)ACE、ACE2比例失衡，但對(duì)Mas受體作用有限，提示中藥可能在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶層面改善高血壓心肌損害，從而進(jìn)一步減輕其功能及形態(tài)損傷。

絲裂原激活的蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中，ERK1/2是細(xì)胞信號(hào)中傳遞絲裂原信號(hào)的關(guān)鍵激酶，與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)，pERK1/2是其磷酸化形式。AngⅡ能磷酸化ERK1/2下調(diào)過(guò)氧化氫酶(CAT)并促進(jìn)外膜成纖維細(xì)胞α-actin的升高，表達(dá)外膜成纖維細(xì)胞在向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)血管重塑的發(fā)生。 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)NF-κB的產(chǎn)生，可激發(fā)其他炎癥細(xì)胞因子，觸發(fā)心肌組織內(nèi)的額外損傷[17]。ERK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，例如各種細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和死亡以及炎癥相關(guān)的免疫反應(yīng)[18]。另一個(gè)MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB會(huì)被磷酸化并隨后增加核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)眾多促炎基因的轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)心肌損傷和功能障礙[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組pERK1/2的蛋白表達(dá)明顯增加，說(shuō)明SHR可能存在ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，從而進(jìn)一步導(dǎo)致其心肌細(xì)胞增殖以致心室肥厚、舒張功能損傷等病理改變，各給藥組pERK1/2的蛋白表達(dá)均有所降低，提示藥物可能通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，改善高血壓心肌損傷。結(jié)果還顯示，SHR心肌組織的ACE蛋白表達(dá)增加、ACE2蛋白表達(dá)降低，結(jié)果與相應(yīng)mRNA表達(dá)一致，提示ACE合成增多、ACE2合成減少可能是高血壓心臟損害，以致左心室舒張功能損傷的病理機(jī)制之一，天麻舒心方各劑量組ACE、ACE2蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)與相應(yīng)mRNA表達(dá)基本一致，提示天麻舒心方可能在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶層面改善高血壓心臟損害，從而進(jìn)一步減輕其功能及形態(tài)損傷。

綜上所述，高血壓早期心臟損害表現(xiàn)為左心室舒張功能下降、心肌超微結(jié)構(gòu)損傷及膠原含量的增加，其機(jī)制除血壓升高外，可能與ACE-AngⅡ通路激活，ACE2-Ang(1-7)-Mas通路抑制及其下游ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)，天麻舒心方可能通過(guò)調(diào)節(jié)整體及心肌局部的ACE2-Ang(1-7)通路及其下游ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，改善高血壓心肌超微機(jī)制損傷，延緩左心室舒張功能損傷。