分光光度法與酶標(biāo)儀微量法測量菌液濃度的比較

石冬月 遼寧省撫順市望花區(qū)疾病預(yù)防控制中心 （遼寧 撫順 113001）

內(nèi)容提要： 目的：比較分析分光光度法與酶標(biāo)儀微量法測量菌液濃度的效果。方法：2019年10月～2019年11月選取本中心保存的大腸桿菌作為研究對象，分別使用紫外-可見分光光度計、ANTHOS READER 2010酶標(biāo)儀對大腸桿菌進(jìn)行檢測，對比兩種檢測方法獲得的菌液濃度。結(jié)果：以重量法檢測結(jié)果為準(zhǔn)，按照一系列比例稀釋后測量吸光度，繪制相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線，獲得相應(yīng)的回歸方程。回歸方程y=0.0095+0.7115x，其中r2=0.9982。從四個樣品的菌液濃度檢測結(jié)果可以看出，分光光度法與酶標(biāo)儀微量法測出的菌液濃度比較，并無明顯差異（P＞0.05）。兩種檢測方法的測量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均比3%小，但相較于分光光度法，酶標(biāo)儀微量法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更?。≒＜0.05）。酶標(biāo)儀微量法測量菌液濃度的精密度比分光光度法更好（P＜0.05）。結(jié)論：酶標(biāo)儀微量法、分光光度法均可有效檢測菌液濃度，但酶標(biāo)儀微量法所測定的菌液濃度結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，精密度更高，更具應(yīng)用價值。

有研究[1]指出，分光光度法可通過對物質(zhì)的定性與定量，達(dá)到動態(tài)監(jiān)測菌液濃度的目的?，F(xiàn)今，這種方法在臨床廣泛應(yīng)用，獲得大量好評。但也有研究[2]指出，分光光度法測定菌液濃度，存在檢測時間長、檢測工作量過大等缺點。隨著酶標(biāo)儀（酶聯(lián)免疫法）在臨床的廣泛應(yīng)用，有研究[3]指出，在菌液濃度監(jiān)測過程中采用酶標(biāo)儀，可獲得理想效果?；诖?，本研究對比分析分光光度法與酶標(biāo)儀微量法測量菌液濃度的效果，報告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

2019年10月～2019年11月選取本中心保存的大腸桿菌作為研究對象，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2 儀器

本研究所用分光光度法所用儀器是上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)的752N型紫外-可見分光光度計，所用酶標(biāo)儀是奧地利Anthos公司生產(chǎn)的ANTHOS READER 2010型酶標(biāo)儀。

1.3 方法

分光光度法：取樣5mL，加熱煮沸，煮沸10min后，按照1:2比例、1:4比例、1:8比例、1:16比例、1:32比例、1:64比例用純水將樣本稀釋成一定濃度，然后在625nm處使用紫外-可見分光光度計檢測吸光度，并在相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線上查詢吸光度對應(yīng)的濃度，并將濃度與稀釋比例相乘，從而獲得所選樣本的菌液濃度。

酶標(biāo)儀微量法：取樣5mL，加熱煮沸，煮沸10min后，按照1:2比例、1:4比例、1:8比例、1:16比例、1:32比例、1:64比例用純水將樣本稀釋成一定濃度，將不同濃度的稀釋液加入未經(jīng)過任何處理的酶標(biāo)板孔洞中，每一孔洞添加250μL稀釋液。然后在酶標(biāo)儀625nm處測定其吸光度值，并在相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線上查詢吸光度對應(yīng)的濃度，并將濃度與稀釋比例相乘，從而獲得所選樣本的菌液濃度。

1.4 觀察指標(biāo)

以重量法測出的大腸桿菌菌體濃度結(jié)果為檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)，對比兩種檢測方法獲得的菌體濃度，并分析兩種方法的檢測準(zhǔn)確度。選取4個不同樣品應(yīng)用兩種檢測方法檢測，確定兩種方法的精密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.結(jié)果

2.1 繪制校準(zhǔn)曲線

將重量法獲取的菌液濃度檢測結(jié)果作為基準(zhǔn)數(shù)據(jù)，按照一系列比例稀釋后測量吸光度，并繪制相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線，獲得相應(yīng)的回歸方程?；貧w方程y=0.0095+0.7115x，其中r2=0.9982。從回歸方程可看出，校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

2.2 兩種檢測方法獲得的菌液濃度

從四個樣品的菌液濃度檢測結(jié)果可以看出，分光光度法與酶標(biāo)儀微量法測出的菌液濃度比較，并無明顯差異（P＞0.05），詳情見表1。

表1. 兩種檢測方法獲得的菌液濃度(g·l)

2.3 兩種檢測方法測量菌液濃度的精密度

從四個樣品菌液濃度檢測結(jié)果精密度試驗可以看出，兩種檢測方法的測量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均比3%小，但相較于分光光度法，酶標(biāo)儀微量法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更?。≒＜0.05）。主要是因為酶標(biāo)儀應(yīng)用垂直光路，分光光度法應(yīng)用水平光路，使用垂直光路，樣本吸光度不容易被稀釋液、液體濃縮等因素影響。因此，酶標(biāo)儀微量法測量菌液濃度的精密度比分光光度法更好（P＜0.05），詳情見表2。

表2. 兩種檢測方法測量菌液濃度的精密度

3.討論

微生物發(fā)酵期間，必須加強監(jiān)測，動態(tài)分析發(fā)酵菌液的濃度，才能有效控制發(fā)酵工藝，保證微生物如預(yù)期目標(biāo)發(fā)酵，發(fā)酵后可獲得預(yù)期結(jié)果。但如何監(jiān)測發(fā)酵菌液成為了臨床的熱點與難點。隨著我國臨床檢測手段的發(fā)展和進(jìn)步，各種檢測方法均在菌液濃度檢測中得以應(yīng)用，如比濁法、重量法、稀釋平板計數(shù)法、電導(dǎo)率法、分光光度法等。但是有研究[4]指出，比濁法與重量法在菌液濃度的測定中的應(yīng)用，存在較大誤差，檢測步驟繁瑣，檢測時間漫長，無法滿足臨床實時、動態(tài)監(jiān)測細(xì)菌濃度的要求。

分光光度法以分子吸收光譜為檢測基礎(chǔ)，所用檢測設(shè)備簡單好操作，還具有檢測準(zhǔn)確度高、檢測精密度好、適用性剛等優(yōu)點?，F(xiàn)今在醫(yī)學(xué)、食品、地質(zhì)、能源、環(huán)境等諸多領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，可發(fā)揮重要作用。再者，分光光度法隨著有機試劑、多元絡(luò)合物等發(fā)展，如今已經(jīng)成為臨床應(yīng)用最廣的一種檢測分析手段。最早分光光度法主要在化合物、無機離子的定性分析、定量測定中應(yīng)用。但隨著光譜學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)今分光光度法在醫(yī)學(xué)、細(xì)菌的檢測中廣泛應(yīng)用，但該方法本身的操作比較繁瑣、測量耗時長、對試劑量的需求比較大、難以更為精準(zhǔn)的檢測微量物質(zhì)。

酶標(biāo)儀微量法隨著酶聯(lián)免疫吸附試驗的發(fā)展而發(fā)展，該方法主要在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用，不少醫(yī)療機構(gòu)、疾控機構(gòu)、采血站用該方法檢測HIV抗體、梅毒、各種肝炎等。有研究指出，酶標(biāo)儀微量法用于細(xì)菌檢測，也可獲得理想效果。本研究贊成這一觀點，本研究結(jié)果顯示，分光光度法與酶標(biāo)儀微量法測出的菌液濃度比較，并無明顯差異；但酶標(biāo)儀微量法測量菌液濃度的精密度比分光光度法更好。

由上可知，酶標(biāo)儀微量法、分光光度法均可有效檢測菌液濃度，但酶標(biāo)儀微量法的精密度更好，更值得應(yīng)用。