羰基還原酶的克隆、異源表達(dá)及其在(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯合成中的應(yīng)用

龐凱南，王鑫情，朱佳妮，來(lái)婉琪，劉銳華，邵飛鴻，黃一帆，羅 希

(臺(tái)州學(xué)院 生物質(zhì)資源研究所，浙江 臺(tái)州 318000)

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已成為危害人類健康的頭號(hào)殺手，其中高血壓是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[1]。普利類藥物，如卡托普利、依那普利、貝那普利、賴諾普利和雷米普利等，能抑制體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，切斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，阻斷血管緊張素Ⅱ的形成，從而達(dá)到擴(kuò)張血管、降低血壓的作用，是目前市場(chǎng)上治療高血壓的主要藥物[2-3]。(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(R-HPBE)是制備普利類藥物的關(guān)鍵手性中間體[4]。

近年來(lái)，一系列化學(xué)和生物過(guò)程被用于合成R-HPBE?；瘜W(xué)法多采用過(guò)渡金屬催化劑和多步溶劑萃取，產(chǎn)物分離純化困難、反應(yīng)條件苛刻、產(chǎn)物光學(xué)純度差。而生物合成法具有立體選擇性高、環(huán)境友好、反應(yīng)條件溫和等突出優(yōu)勢(shì)，更符合綠色合成要求，因而受到了廣泛的關(guān)注[5]。微生物來(lái)源廣泛、生長(zhǎng)周期短且具有豐富的多樣性，是廉價(jià)易得的生物催化劑，可催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)不對(duì)稱還原制備R-HPBE。但微生物細(xì)胞內(nèi)多種不同立體選擇性還原酶共存且酶表達(dá)量低，使得產(chǎn)物光學(xué)純度不高，產(chǎn)物累積濃度也普遍較低[6]。大腸桿菌(Escherichiacoli)易于操控，重組蛋白表達(dá)量約占細(xì)胞內(nèi)總表達(dá)量的55%，常用作異源基因表達(dá)宿主[7]。已有多種不同來(lái)源的羰基還原酶在大腸桿菌中表達(dá)，高效催化OPBE不對(duì)稱還原，獲得光學(xué)純R-HPBE。如Ni等[8]將來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的羰基還原酶IolS與葡萄糖脫氫酶共表達(dá)，在水/正辛醇兩相反應(yīng)體系中催化OPBE不對(duì)稱還原，獲得光學(xué)純R-HPBE，時(shí)空產(chǎn)率為660 g/(L·d)。Shen等[9]將來(lái)源于光滑假絲酵母(Candidaglabrata)的羰基還原酶CgKR2與葡萄糖脫氫酶耦聯(lián)，在水相中催化合成R-HPBE，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到700 g/(L·d)，對(duì)映體過(guò)量值(e.e.)>99%。

雖然，到目前為止已有一些野生型微生物和羰基還原酶重組菌被應(yīng)用于不對(duì)稱合成R-HPBE，發(fā)現(xiàn)新型的、有潛力的生物催化劑依然是手性中間體合成研究的重要課題。新的生物催化劑的發(fā)現(xiàn)，不僅可為包括R-HPBE在內(nèi)的手性中間體綠色制造提供更多選擇方案，也可為應(yīng)用蛋白質(zhì)工程改造酶的催化功能和特性提供材料，以加深酶結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，本研究中，筆者篩選一株具有催化OPBE不對(duì)稱還原制備R-HPBE活性的野生型微生物菌株，并通過(guò)基因挖掘獲得關(guān)鍵酶基因，構(gòu)建重組大腸桿菌并異源表達(dá)，用于全細(xì)胞催化合成R-HPBE，考察其反應(yīng)工藝，為規(guī)?；a(chǎn)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨和酵母粉，Oxoid(英國(guó))；分子克隆和重組大腸桿菌構(gòu)建所用酶和試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司或TaKaRa公司；2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯等，百靈威科技有限公司；其他試劑均為市售分析純。

野生菌篩選所需土樣取自于浙江省內(nèi)農(nóng)田、果園、湖泊及化工廠等環(huán)境。

1.2 野生菌的篩選

稱取不同土樣各0.5 g，加無(wú)菌水10 mL懸浮，放至30 ℃恒溫?fù)u床中孵育1 h制備土壤菌懸液。吸取菌懸液1 mL分別加入LB培養(yǎng)基和豆芽汁培養(yǎng)基中，分別在30和28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至培養(yǎng)液渾濁。取1 mL富集培養(yǎng)液，梯度稀釋。分別吸取106、107和108倍稀釋的富集培養(yǎng)液50 μL，加入瓊脂平板，玻璃涂布棒涂布均勻，并放至恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(LB瓊脂平板30 ℃，豆芽汁平板28 ℃)至長(zhǎng)出顯著單菌落。挑取單菌落，分別接種至新鮮LB培養(yǎng)基(30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h)，或豆芽汁培養(yǎng)基(28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h)。在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集細(xì)胞并置于4 ℃冰箱備用。

催化反應(yīng)在50 mL搖瓶中進(jìn)行，稱取0.05 g OPBE、0.05 g葡萄糖至裝有不同菌種細(xì)胞的離心管中，加入10 mL磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH7.0)，充分懸浮后，于30 ℃、200 r/min搖床中反應(yīng)12 h，取樣后以2,4-二硝基苯肼顯色法初篩[10]，確定活性菌株后再采用氣相色譜法復(fù)篩。

1.3 菌種鑒定

將目標(biāo)菌株培養(yǎng)物適當(dāng)稀釋后涂布于富集培養(yǎng)基固體平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)生單菌落后觀察形態(tài)。電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。16S、18S rDNA 的分子生物學(xué)鑒定：提取活性菌基因組DNA，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.4 羰基還原酶的克隆和重組基因工程菌的構(gòu)建

以羰基還原酶(CR)氨基酸序列(GenBank：PTN20075.1)為探針，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST功能進(jìn)行比對(duì)分析，找出來(lái)源于Kazachstanianaganishii菌種的相似序列。以K.naganishii基因組為模板，CR-F 5’-CCATGGGCATGTCCGTTT TTATCTCAGG-3’(NcoⅠ)，CR-R 5’-CTCGAGTAGGTTCCCTTCGTGTTTC-3’(XhoⅠ)為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，克隆酶基因。PCR反應(yīng)體系(總體積100 μL)：10×Taq DNA Polymerase Buffer 10 μL(Mg2+)，引物CR-F和CR-R各1 μL(50 μmol/L)，dNTP mixture 1 μL(10 mmol/L)，基因組DNA 1 μL，Taq DNA Polymerase 1 μL，去離子水85 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 0.5 min，56 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.5 min)，72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收目標(biāo)酶DNA，雙酶切獲得黏性末端插入表達(dá)載體pET-28a，重組質(zhì)粒用熱擊法轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建羰基還原酶基因工程菌。

1.5 羰基還原酶重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

接種E.coli/pET-28a-kncr至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h，轉(zhuǎn)接(4%，體積分?jǐn)?shù))至有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600為0.8，加入乳糖，在28 ℃、150 r/min下誘導(dǎo)，分別對(duì)誘導(dǎo)劑乳糖的用量(2、4、6、8、10和12 g/L)和誘導(dǎo)時(shí)間(2、4、6、8和10 h)進(jìn)行優(yōu)化。離心收集菌體。

生物量測(cè)定：取誘導(dǎo)完成的發(fā)酵液1 mL，稀釋10倍，在600 nm下測(cè)定吸光值。細(xì)胞超聲破碎后離心，上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

酶活測(cè)定反應(yīng)體系(200 μL)：0.25 mmol/L NADH，1 mmol/L OPBE，100 μL粗酶液溶于磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH7.0)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD340的變化值。酶活定義：在30 ℃、pH7.0條件下，反應(yīng)消耗1 μmol NADH所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(1 U)。

1.6 全細(xì)胞催化反應(yīng)條件優(yōu)化

羰基還原酶重組菌細(xì)胞，OPBE和葡萄糖溶于10 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L)。分別對(duì)pH(6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、溫度(25、30、35、40和45 ℃)、葡萄糖(5、10、15、20、25和30 g/L)、細(xì)胞用量(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g)、底物質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25和30 g/L)進(jìn)行優(yōu)化，于200 r/min反應(yīng)30 min后取樣，乙酸乙酯萃取后氣相色譜檢測(cè)。

1.7 全細(xì)胞催化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

催化反應(yīng)體系50 mL，在篩選后的最優(yōu)條件下進(jìn)行，磁力攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為500 r/min，流加1 mol/L Na2CO3溶液維持反應(yīng)液pH恒定。每1 h取樣，氣相檢測(cè)。

1.8 檢測(cè)方法

HPBE濃度和R-HPBE對(duì)映體過(guò)量值(e.e.)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選與鑒定

微生物是酶的天然寶庫(kù)，與基于數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘法相比，從野生型微生物體內(nèi)獲得所需新酶的幾率更高。選取農(nóng)田、果園、湖泊和化工廠等腐殖質(zhì)較多、微生物物種豐富的土壤作為土樣，經(jīng)富集培養(yǎng)及分離純化，共獲得236株野生菌。通過(guò)2,4-二硝基苯肼顯色法初篩和氣相色譜復(fù)篩，獲得19株形態(tài)各異的野生型菌種。其中，編號(hào)為DY99的菌株能催化不對(duì)稱還原OPBE反應(yīng)，獲得R-HPBE 2.47 g/L，顯示了較優(yōu)催化活力，且產(chǎn)物e.e.也較高，達(dá)到91.3%(圖1(a))。在豆芽汁固體培養(yǎng)平板上，DY99菌落呈白色、圓球形、凸起、表面光滑、邊緣整齊、不透明狀(圖1(b))。經(jīng)顯微鏡觀察，DY99細(xì)胞呈卵圓形，少數(shù)細(xì)胞正進(jìn)行出芽生殖(圖1(c))，初步判定為酵母細(xì)胞。為進(jìn)一步確定該菌種屬，將PCR擴(kuò)增獲得的18S rDNA測(cè)序獲得序列并輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLAST軟件將該序列與NCBI收錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：菌株DY99與Kazachstanianaganishii同源性最高(100%，18S rDNA序列GenBank：AB016512.1)。結(jié)合形態(tài)特征，DY99確定為Kazachstanianaganishii。

圖1 菌種篩選

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 羰基還原酶基因的克隆與重組工程菌構(gòu)建

挖掘到1株推定的羰基還原酶，其氨基酸序列(NCBI號(hào)：XP_022464010.1)與探針酶相似度為59.18%，與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的具有較高R-HPBE產(chǎn)率的羰基還原酶IolS和CgKR2相比，氨基酸序列相似度分別為11.9%和12.2%。

以K.naganishii基因組為模板，采用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行RCR擴(kuò)增，將獲得的DNA產(chǎn)物分析后，插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主進(jìn)行表達(dá)，并用電泳分析鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：通過(guò)PCR得到約1 000 bp條帶(圖3(a))，與目標(biāo)基因一致(1 049 bp)；將擴(kuò)增獲得的基因插入pET-28a表達(dá)載體(圖3(b))，并將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得的重組大腸桿菌E.coli-pET28-kncr經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后，SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖3(c))，獲得約4.0×104蛋白條帶，與目標(biāo)蛋白CR預(yù)測(cè)分子量一致(3.846×104)。由此可知，重組CR菌構(gòu)建成功。

圖3 E. coli-pET28-kncr重組菌構(gòu)建

2.3 羰基還原酶重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

為獲得最佳誘導(dǎo)條件，對(duì)誘導(dǎo)劑(乳糖)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：增加乳糖有利于細(xì)胞的增殖，在較低乳糖(0～6 g/L)條件下，乳糖的增加有利于酶的合成，發(fā)酵液總酶活也隨之增加，但當(dāng)乳糖超過(guò)6 g/L，酶蛋白可溶性表達(dá)量逐漸降低，導(dǎo)致發(fā)酵液的總酶活下降。采用6 g/L乳糖為誘導(dǎo)劑時(shí)，生物量和總酶活均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但在誘導(dǎo)12 h后，酶蛋白可溶性表達(dá)量開(kāi)始下降，導(dǎo)致總酶活降低。由此可知，在最佳誘導(dǎo)條件(28 ℃、150 r/min、6 g/L乳糖誘導(dǎo)12 h)下，最高總酶活為330.61 U/L。

圖4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.4 催化反應(yīng)條件優(yōu)化

pH的變化會(huì)引起酶分子構(gòu)象、酶和底物的解離狀態(tài)發(fā)生變化，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合，使酶促反應(yīng)速率發(fā)生變化。采用不同pH的磷酸鉀緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，在10 mL反應(yīng)體系中，添加OPBE 10 g/L，葡萄糖5 g/L，重組菌細(xì)胞20 g/L(以干質(zhì)量計(jì))，在30 ℃、200 r/min條件下研究pH對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5(a)。由圖5(a)可知：隨著pH的升高，產(chǎn)物累積濃度也逐漸增大，至pH7.5時(shí)最大，達(dá)到1.13 g/L；繼續(xù)增大pH導(dǎo)致產(chǎn)物累積濃度下降。在所研究的范圍內(nèi)，pH的改變未引起酶立體選擇性的顯著變化，不同pH條件下產(chǎn)物的e.e.均大于99%。由此確定，反應(yīng)最適pH為7.5。

在一定范圍內(nèi)，溫度的升高有助于酶分子與底物分子的有效碰撞，從而使酶促反應(yīng)速率加快；而另一方面，隨著溫度的升高，酶分子變性加劇，活性酶分子減少，反應(yīng)速率降低。酶促反應(yīng)最適溫度是這兩方面因素平衡的結(jié)果。在10 mL反應(yīng)體系中，添加OPBE 20 g/L，葡萄糖5 g/L，重組菌細(xì)胞10 g/L(以干質(zhì)量計(jì))，以100 mmol/L磷酸鉀緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，控制pH為7.5，溫度25～45 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行不對(duì)稱催化反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖5(b)。由圖5(b)可知：當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，產(chǎn)物累積濃度達(dá)到峰值，繼續(xù)升高溫度，酶變性失活加劇，產(chǎn)物累積濃度變小。當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，反應(yīng)液由澄清透明逐漸變渾濁，有白色黏稠固體產(chǎn)生，產(chǎn)物累積質(zhì)量濃度僅為0.49 g/L。由此可見(jiàn)，羰基還原酶重組菌催化OPBE不對(duì)稱還原獲得R-HPBE最適反應(yīng)溫度為30 ℃。由于野生菌細(xì)胞中含有不同選擇性的還原酶，因此以野生菌細(xì)胞為催化劑還原OPBE生成產(chǎn)物的光學(xué)純度不高，采用基因工程技術(shù)克隆單個(gè)還原酶，構(gòu)建重組菌并異源表達(dá)酶蛋白來(lái)催化不對(duì)稱還原反應(yīng)，可獲得光學(xué)純的產(chǎn)物。

煙酰胺輔酶是氧化還原反應(yīng)中的關(guān)鍵影響因素。葡萄糖可作為氫供體，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)輔酶再生。在10 mL反應(yīng)體系中，添加OPBE 10 g/L，葡萄糖5～30 g/L，重組菌細(xì)胞20 g/L(以干質(zhì)量計(jì))，以100 mmol/L磷酸鉀緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，控制pH為7.5，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行不對(duì)稱催化反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖5(c)。由圖5(c)可知：當(dāng)葡萄糖為10 g/L(與OPBE濃度相同)時(shí)，產(chǎn)物累積質(zhì)量濃度達(dá)到最大值1.56 g/L，e.e.>99%；再增加葡萄糖用量，反應(yīng)液黏度升高，傳質(zhì)阻力增大，反而使R-HPBE濃度下降。由此可見(jiàn)，當(dāng)葡萄糖與底物按1∶1(質(zhì)量比)添加，不對(duì)稱還原反應(yīng)速率最大，能獲得最大產(chǎn)物累積量。

在10 mL反應(yīng)體系中，添加OPBE 10 g/L，葡萄糖10 g/L，重組菌細(xì)胞10～50 g/L(以干質(zhì)量計(jì))，以100 mmol/L磷酸鉀緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，控制pH為7.5、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行不對(duì)稱催化反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖5(d)。由圖5(d)可知：E.coli-pET28-kncr細(xì)胞生物量為20 g/L(以干質(zhì)量計(jì))時(shí)，R-HPBE累積量最大，為最適細(xì)胞生物量。增大細(xì)胞生物量也會(huì)引起反應(yīng)體系的黏度增加，使反應(yīng)速率緩慢下降，導(dǎo)致產(chǎn)物積累量減少。

圖5 全細(xì)胞催化OPBE不對(duì)稱還原反應(yīng)條件優(yōu)化

在已獲得的最優(yōu)條件下，考察了底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5(e)所示。由圖5(e)可知：在較低底物用量(5～15 g/L)時(shí)，底物用量的增加有利于反應(yīng)速率的提升，產(chǎn)物累積濃度增加；最適底物為15 g/L，在上述最適條件下，經(jīng)歷0.5 h反應(yīng)后，產(chǎn)物累積質(zhì)量濃度為1.88 g/L，e.e.>99%，但是進(jìn)一步提高底物濃度，反應(yīng)速率降低，表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)物抑制。

2.5 全細(xì)胞催化不對(duì)稱還原反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

反應(yīng)在100 mL三頸圓底燒瓶中進(jìn)行，反應(yīng)體系50 mL，含15 g/L OPBE、15 g/L 葡萄糖、20 g/LE.coli-pET28-kncr細(xì)胞和50 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH7.5)，恒溫磁力攪拌器控制溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速500 r/min，流加1 mol/L Na2CO3使pH維持在7.5，反應(yīng)12 h考察全細(xì)胞催化不對(duì)稱還原反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程，每1 h取樣進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物OPBE不斷消耗，產(chǎn)物R-HPBE不斷累積，當(dāng)產(chǎn)物達(dá)到11 g/L時(shí)，底物消耗變得緩慢，至反應(yīng)10 h后基本不變，維持在約3 g/L，由此可知，羰基還原酶的酶活受到高濃度產(chǎn)物的抑制。R-HPBE累積質(zhì)量濃度在10 h時(shí)達(dá)到最大(11.2 g/L)，產(chǎn)物得率為74.7%，時(shí)空產(chǎn)率為26.88 g/(L·d)，產(chǎn)物e.e.至始終維持在99%以上。

圖6 E.coli-pET28-kncr全細(xì)胞催化OPBE不對(duì)稱還原反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

表1為不同羰基還原酶重組菌不對(duì)稱催化合成R-HPBE的結(jié)果。由圖表1可知：應(yīng)用KnCR重組菌全細(xì)胞催化合成R-HPBE效率與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的最大值700.0 g/(L·d)還有較大的差距。本實(shí)驗(yàn)還存在著一些問(wèn)題，一是存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，二是缺少煙酰胺輔酶再生系統(tǒng)。Liu等[12]以來(lái)源于圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的羰基還原酶重組菌為催化劑，以水-正辛醇(4∶1，體積比)兩相體系為反應(yīng)介質(zhì)，催化(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱還原，反應(yīng)在9 h內(nèi)達(dá)到平衡，每克濕細(xì)胞生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的時(shí)空產(chǎn)率為4.08 mmol/(L·h)，是單水相介質(zhì)催化時(shí)空產(chǎn)率的1.12倍。Shah等[13]在體積比為1∶1.5的水-甲苯介質(zhì)中應(yīng)用來(lái)源于醋酸桿菌(Acetobacteraceti)的醇脫氫酶，催化合成(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯的時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到650.4 g/(L·d)。篩選合適的有機(jī)溶劑，構(gòu)建水-有機(jī)兩相反應(yīng)介質(zhì)能減輕甚至消除底物和產(chǎn)物抑制，因此能有效增強(qiáng)催化反應(yīng)效率。羰基還原酶需要還原型煙酰胺輔酶(NAD(P)H)傳遞氫和電子，所以還原型煙酰胺輔酶的充分供應(yīng)，是不對(duì)稱還原反應(yīng)順利進(jìn)行的重要保障。然而，還原型煙酰胺輔酶價(jià)格昂貴，批量使用會(huì)大幅抬高生產(chǎn)成本。Chen等[14]用葡萄糖脫氫酶還原再生NADPH，并與來(lái)自開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefir)的醇脫氫酶耦聯(lián)不對(duì)稱催化合成(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，僅添加0.05 g/L NADP+，60 g/L底物在6 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，生成產(chǎn)物e.e.為99.5%。Li等[15]通過(guò)加入甲酸-甲酸脫氫酶輔酶原位再生系統(tǒng)，使二乙酰還原酶KpDAR不對(duì)稱還原合成(S)-3-hydroxy-2-butanone累積量由39.4 g/L提升至52.9 g/L，時(shí)空產(chǎn)率2.0 g/(L·h)增加到6.2 g/(L·h)。由此可見(jiàn)，添加輔酶來(lái)再生酶，構(gòu)建雙酶耦聯(lián)輔酶原位再生體系，是解除輔酶限制、降低生產(chǎn)成本的常用方法。

表1 不同羰基還原酶重組菌不對(duì)稱催化合成R-HPBE的結(jié)果

3 結(jié)論

篩選獲得了一株具有催化OPBE不對(duì)稱還原生成血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類降壓藥關(guān)鍵手性中間體R-HPBE的野生型菌種，鑒定為Kazachstanianaganishii。通過(guò)基因挖掘，獲得了羰基還原酶基因序列，克隆獲得了酶基因并構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coli-pET28-kncr。以重組羰基還原酶為催化劑，以潛手性化合物OPBE為底物，不對(duì)稱合成R-HPBE。優(yōu)化獲得了重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)條件：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物OD600達(dá)到0.8時(shí)，以6 g/L乳糖為誘導(dǎo)劑，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h，在30 ℃、pH7.5磷酸緩沖液中，底物、葡萄糖、細(xì)胞生物量分別為15、15和20 g/L(以干質(zhì)量計(jì))時(shí)，重組菌全細(xì)胞催化反應(yīng)效率最高，為最適反應(yīng)條件；在上述最優(yōu)條件下，50 mL恒pH反應(yīng)獲得光學(xué)純R-HPBE，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到26.88 g/(L·h)，具備了工業(yè)化應(yīng)用前景。但在反應(yīng)過(guò)程中底物和產(chǎn)物均對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生明顯抑制，使應(yīng)用該羰基還原酶生產(chǎn)R-HPBE受到限制。