漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花提取物產香氣物質及其應用

張倩穎，羅 誠，李東亮，丁重陽

(1.四川中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心，四川 成都 610066；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

香精香料在食品、飼料、化妝品、化學和制藥等領域具有極其重要的作用，與人們日常生活息息相關。使用香精香料能夠改進產品性能，提升品質[1]。傳統(tǒng)香精香料的配制方法多以天然提取或化學合成的單體混合調配而成，難以形成具有獨特香氣的香精香料[2]。

微生物發(fā)酵能夠產生種類多樣的香氣物質，形成豐富而獨特的香氣[2-4]。隨著人們對綠色健康生活的追求，利用微生物制備安全綠色的天然香精香料成為研究熱點。目前，已有100多種利用細菌、真菌和酵母等微生物制備的天然香精香料實現(xiàn)了商品化[5]。

本研究將德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)L1-1、樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)CICC1960和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BNCC185415這3株產香酵母與薰衣草、玫瑰花、紫羅蘭、菊花、槐花、桂花和白芍花這7種具有獨特香韻的花進行組合發(fā)酵，篩選出一組菌株-花組合。在此基礎上以感官為導向，采用單因素法和田口實驗設計法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到一個最優(yōu)培養(yǎng)基并從中提取制備出一種風格獨特的天然香料，分析了提取物中半揮發(fā)性成分及常見香氣成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

漢遜德巴利酵母L1-1、樹干畢赤酵母CICC1960和釀酒酵母BNCC185415保藏于江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室。

1.1.2 主要儀器設備

Trace 1310-ISQ LT型三重四級桿氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取萃取頭，美國Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L。

菌株活化：取-80 ℃保藏的菌株轉接入種子培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，活化2代，待用。

菌株發(fā)酵：接種活化好的菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)5 d。

1.2.2 酵母-花組合篩選

將活化后的德巴利酵母L1-1、樹干畢赤酵母CICC1960和釀酒酵母BNCC185415等3株酵母接種于滅菌的薰衣草、玫瑰花、紫羅蘭、菊花、槐花、桂花和白芍花，產生21種酵母-花組合，滅菌鑰勺混勻，28 ℃培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結束后對產物進行提取，對提取物進行產香效果評價，選取對卷煙品質具有顯著提升效果的酵母-花組合，進行后續(xù)培養(yǎng)基優(yōu)化研究。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

單因素實驗：以槐花為基礎培養(yǎng)基，分別添加不同質量的葡萄糖、甘油、豆粕粉、玉米粉、土豆汁、麥芽糖、麩皮、蔗糖及果糖，發(fā)酵結束后對產物進行提取，對提取物進行產香效果評價，以篩選對產香有促進作用的因子。

田口實驗：根據單因素實驗結果，選取對菌株產香具有促進作用的因子進行后續(xù)優(yōu)化實驗。綜合田口實驗原理，以評吸結果為響應值，實驗設計及數據分析皆采用JMP軟件(version 10.0，SAS Institute Inc.)，因素編碼及自變量水平見表1。

表1 田口實驗變量及編碼水平

1.2.4 產香效果評價

由經驗豐富的卷煙感官評定專家對提取物進行嗅香，篩選出香味與煙香協(xié)調、對卷煙品質可能有提升的提取物，加入卷煙進行卷煙加香評吸。

卷煙加香評吸：取2 μL提取物加入卷煙煙絲，在恒溫恒濕箱內調節(jié)煙支水分48 h，溫度(22±1) ℃，相對濕度60%±3%。參照《YC/T 138—1998煙草及煙草制品·感官評價方法》[6]，由經驗豐富的感官評定專家，對卷煙樣品進行評吸。

根據評吸結果，由香氣特征、煙氣特征及口感特征這三方面進行賦分，81～95分為極顯著提高卷煙質量(+++)，66～80分為顯著提高卷煙質量(++)，51～65分為提高卷煙質量(++)，36～50分為與空白對照組相似(±)，21～35分為降低卷煙感官質量(-)，6～20分為顯著降低卷煙感官質量(--)。

1.2.5 發(fā)酵液中半揮發(fā)性物質分析

采用頂空固相微萃取結合氣質聯(lián)用(SPME-GC/MS)測定提取物中半揮發(fā)性物質，以2-辛醇為內標。頂空固相微萃取條件：萃取頭在GC進樣口老化至無雜峰，在60 ℃下萃取30 min，被吸附的半揮發(fā)性化合物在GC進樣口260 ℃解吸1 min，沖入GC色譜柱，同時啟動儀器采集數據。氣相色譜條件：色譜柱為DB/WAX，載氣為He，流速為1.2 mL/min；程序升溫條件為50 ℃維持2 min，3 ℃/min升溫至180 ℃，15 ℃/min升溫至230 ℃，維持8 min。質譜條件：接口溫度230 ℃，離子源溫度260 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離電勢70 eV，離子化模式EI+，質量掃描范圍(m/z)為33～350。檢測獲得的質譜數據經過與NIST標準質譜檢索庫進行檢索比對鑒定，由內標法計算各組分的相對含量。

2 結果與討論

2.1 酵母-花組合篩選

將3株產香效果較好的酵母菌接種于7種特色植物進行發(fā)酵，觀察酵母發(fā)酵情況，發(fā)現(xiàn)從第2天開始，酵母菌在7種植物組成的培養(yǎng)基中均有明顯生長。選取菌株長勢良好的培養(yǎng)物進行提取，選取嗅香較好且可能對卷煙品質具有顯著提升的樣品進行卷煙加香評吸，嗅香及評吸結果見表2。

表2 嗅香及評吸結果

由表2可知：與對照相比，發(fā)酵后的樣品外香發(fā)生了明顯變化，香氣變化程度和對卷煙品質影響程度與菌株和底物均有明顯關系。具體來說，經過3株酵母發(fā)酵后的薰衣草組樣品和樹干畢赤酵母CICC1960發(fā)酵玫瑰花樣品中表現(xiàn)出了不愉快的香氣，氣味較未發(fā)酵樣品差；發(fā)酵后的紫羅蘭和白芍花香氣變化較大，但與對照相比，卷煙感官品質提升不明顯，漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵后的紫羅蘭和白芍花樣品甚至降低了卷煙的感官品質；經發(fā)酵后的菊花提取物均帶有醬甜香氣，菊花組提取物在卷煙刺激和雜氣等方面有所改善；漢遜德巴利酵母L1-1和釀酒酵母BNCC185415發(fā)酵后的桂花提取物，特征香氣較未發(fā)酵提取物弱，但加入卷煙后能夠豐富卷煙煙香、改善余味和增強回甜感；漢遜德巴利酵母L1-1和樹干畢赤酵母CICC1960發(fā)酵后的槐花提取物均表現(xiàn)為“弱槐花特有香氣，帶清甜酒香”，但是對卷煙的感官影響差異較大，前者表現(xiàn)為“豐富香韻，增加煙氣濃度和飽滿度，降低刺激性(++)”，后者表現(xiàn)為“煙氣渾濁、發(fā)干，刺激增大，口腔辣苦(--)”。

槐花(FlosSophorae)是豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花朵，乳白色，蝶形花冠，為我國首批藥食同源的花卉植物。槐花不僅營養(yǎng)豐富，還含有刀豆酸、槐花二醇、蘆丁和槲皮素等活性物質[7]，且香氣素雅、清香持久[8]，是一種具有開發(fā)利用價值的香味原料。漢遜德巴利酵母為常見的生香酵母，發(fā)酵時會產生較淡的甜酯香，略帶酒香，被廣泛應用于肉制品的制備中[9]。本研究的所有提取物中，漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花的提取物對卷煙品質提升具有最顯著的影響(++)，目前，尚無用漢遜德巴利酵母發(fā)酵槐花生產天然香精香料的報道。因此，本文選取漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花進行后續(xù)培養(yǎng)基優(yōu)化。

2.2 單因素實驗

在槐花培養(yǎng)基中加入不同質量濃度的常見食品級葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、甘油、玉米粉、豆粕粉、土豆汁和麩皮，接種漢遜德巴利酵母L1-1培養(yǎng)后，對培養(yǎng)物進行提取，提取物記為HD，由經驗豐富的卷煙評吸專家進行效果評價，嗅香和評吸結果見表3。

表3 嗅香及評吸結果

根據評吸結果，初步篩選出與煙香協(xié)調且對卷煙質量效果具有較強提升作用(評吸結果“++”和“+++”)的HD葡-1、HD豆-1、HD豆-3、HD玉-1、HD麥-2和HD果-1，由經驗豐富的卷煙評吸專家對卷煙進行復評，結果見表4。

表4 復評結果

根據感官評吸結果，篩選葡萄糖、豆粕粉、玉米粉、麥芽糖和果糖等5個因子進行田口實驗。

2.3 田口實驗

田口設計(Taguchi design)實質上是利用正交數組進行設計實驗，其能夠在眾多實驗變量中篩選出最少變量以滿足實驗需要[10]。在優(yōu)化設計中利用田口設計具有多個變量能夠被同時優(yōu)化，在較少的實驗組數中能夠得到較多相關因子的定量信息等優(yōu)點[11]，已經被廣泛應用于發(fā)酵工業(yè)[12-14]。根據單因素實驗結果，以發(fā)酵提取物感官評吸平均值為響應，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，田口實驗設計培養(yǎng)基方案及評吸賦值結果見表5。

對表5中實驗結果進行方差分析，結果見表6。

表5 田口實驗設計及響應值

表6 回歸方程方差分析

表7 偏回歸系數及顯著性檢驗

由表7可知：對漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花發(fā)酵產物感官評定具有顯著影響的因素有葡萄糖、豆粕粉、麥芽糖和果糖(P<0.05)。同時，軟件給出了感官評定分值最高時的最優(yōu)培養(yǎng)基配方：X1(葡萄糖)、X2(豆粕粉)、X3(玉米粉)、X4(麥芽糖)和X5(果糖)分別對應水平L3、L2、L2、L3和L2，預測評吸值(圖1中以Y表示)為80.6分，其概率(圖1中以意愿表示)為88.06%(圖1)。意愿為達到軟件預測的感官最大值的概率。紅色的L2和L3等為軟件預測最大響應下，即軟件預測的最大評吸值下對應因素的水平，紅色為軟件自帶。

圖1 軟件預測評吸最大值

在軟件給出的最優(yōu)條件下進行3次平行實驗，將該培養(yǎng)基發(fā)酵提取物加入卷煙進行評吸，與空白卷煙相比，加香卷煙煙香豐富、煙氣蓬松流暢、圓潤、細膩，刺激性降低，得出評吸值為(88±2)分，實驗值和理論值的相對標準偏差(RSD)為9.18%?？梢?，本研究采用的單因素實驗結合田口實驗設計，對漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花培養(yǎng)基進行優(yōu)化效果良好。

2.4 發(fā)酵液半揮發(fā)性物質測定

測定漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花提取物(HD)半揮發(fā)性物質，以槐花未發(fā)酵樣品提取物(記為H)作為對照，總離子流圖見圖2，成分分析結果見表8。

圖2 未發(fā)酵(a)與發(fā)酵(b)槐花提取物總離子流

由表8可知：在2個樣品中共鑒定出51種半揮發(fā)性物質。在H樣品中共鑒定出33種半揮發(fā)性物質，半揮發(fā)性物質的總含量為2 424.00 mg/L，其中2-乙基己酸和芳樟醇為含量最高的2種物質，含量分別為334.45和332.36 mg/L。在HD中共檢出41種半揮發(fā)性物質，半揮發(fā)性物質的總含量為8 821.7 mg/L，其中苯乙醇和芳樟醇為含量最高的2種物質，含量分別為4 293.99和1 798.64 mg/L。

表8 半揮發(fā)性物質

進一步分析半揮發(fā)性物質中常見的香味物質，發(fā)現(xiàn)在H和HD樣品中，共檢出29種常見香味物質，包括異戊醇、異丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、苯甲醇、壬醛、異戊酸、苯乙烯、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、3-辛酮、苯乙酮、芳樟醇、脫氫芳樟醇、苯乙醇、冰片、松油烯-4-醇、α-松油醇、桃金娘烯醇、異戊酸芳樟酯、香芹醇、橙花醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、丁香酚、γ-壬內酯、茉莉酮、月桂醇和β-紫羅蘭酮。在H中，香味物質包括除3-辛酮、脫氫芳樟醇、冰片、桃金娘烯醇、香芹醇、丁香酚和月桂醇外的22種物質。這22種香味物質總量為1 780.66 mg/L，其中含量較高的香味物質主要有芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、異戊醇、苯乙醇和橙花醇(332.36～110.57 mg/L)，這6種物質總量占香味物質總量的70.1%。在HD中，也包含22種常見香味物質，具體為除異戊醇、異丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、苯甲醇和壬醛等7種物質以外的物質。在HD中存在的這22種香味物質總量為7 798.00 mg/L，其中苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇(838.49～4 293.99 mg/L)含量較高，這3種物質總量占香味物質含量的88.8%。

異戊醇、異丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、苯甲醇、壬醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、松油烯-4-醇、鄰氨基苯甲酸甲酯和β-紫羅蘭酮等12種香味物質僅在H中被鑒定出或含量高于HD中，3-辛酮、脫氫芳樟醇、冰片、桃金娘烯醇、香芹醇、丁香酚、月桂醇、異戊酸、苯乙烯、苯乙酮、異戊酸芳樟酯和γ-壬內酯等12種香味物質則表現(xiàn)出相反的趨勢。值得注意的是，在HD中苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇等3種物質分別為H的23.2倍、5.4倍和4.1倍。苯乙醇具有水果樣的味道，在卷煙中能夠掩蓋雜氣，增加細膩柔和度，提高香氣；芳樟醇具有典型的花香香氣、柔和透發(fā)，在卷煙中與煙香協(xié)調，能夠增加花香、清香，修飾和矯正自然風味，吸味柔和；α-松油醇具有鮮幽香氣，稀釋后有似桃甜香，與煙香協(xié)調，賦予果香和辛香，改善煙氣新鮮風味[15]。漢遜德巴利酵母L1-1能夠通過一系列分解代謝，利用初始培養(yǎng)基中包含12種香味物質在內的物質，經過合成代謝轉化為包含另外12種香味物質在內的產物，最終使得發(fā)酵后的培養(yǎng)物呈現(xiàn)出“槐花特征香韻減弱、香韻更加柔和且略帶酒香”的特征香韻。

3 結論

從21種酵母-花組合中，篩選得到了一種風格獨特的具有開發(fā)成為天然香料潛力的漢遜德巴利酵母L1-1槐花組合。通過單因素實驗和田口實驗得到了一種最優(yōu)培養(yǎng)基，并制備出了一種香氣獨特的天然香料。該香料能夠增加卷煙甜花香韻，使煙氣圓潤、細膩，降低刺激性。SPME-GC/MS分析表明，該香料中共檢出41種半揮發(fā)性物質，其中包括22種常見香氣成分；未發(fā)酵時常見香味物質含量為1 780.66 mg/L，經過發(fā)酵處理香味物質含量增加到了7 798.00 mg/L，苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇含量為未發(fā)酵樣品的23.2倍、5.4倍和4.1倍。

通過本研究的發(fā)酵策略，改變了槐花特征香氣，得到了一種香氣獨特的天然香料，但是本研究僅研究了發(fā)酵前后提取物中半揮發(fā)性物質的變化情況，德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花產香作用機制和代謝途徑等有待深入研究。