鹵醇脫鹵酶的研究進(jìn)展

王龍興，賈紅華，韋 萍

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

圖1 HHDHs催化的脫鹵與開環(huán)反應(yīng)

在早期的研究中，利用產(chǎn)HHDH的微生物來降解環(huán)境中含有鹵代有機(jī)化合物的污染物，使其在環(huán)境治理方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。之后，通過對HheC突變、結(jié)構(gòu)解析以及動力學(xué)等方面的研究，揭示了HHDH的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及催化脫鹵、開環(huán)的機(jī)制[8-9]，發(fā)現(xiàn)HHDHs在催化制備手性環(huán)氧化物和光學(xué)純的β-取代醇方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值[10]，尤其是在制備降脂藥阿托他汀的前體、手性環(huán)氧氯丙烷等方面，這使得HHDHs應(yīng)用前景更廣闊。因此，本文綜述了近年來關(guān)于HHDHs在來源分布、結(jié)構(gòu)與機(jī)制、分子改造以及生物催化應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展，為相關(guān)的研究者提供參考。

1 HHDHs的來源與分布

HHDHs從發(fā)現(xiàn)到酶家族的擴(kuò)展，經(jīng)過了幾十年的發(fā)展，最初僅發(fā)現(xiàn)了HheA、HheA2、HheB、HheB2和HheC這5種代表性的HHDHs。它們分別來自Corynebacteriumsp. N-1074[11]、Arthrobactersp. AD2[8]、Arthrobactersp. AD2[11]、Arthrobactersp. AD[8]、AgrobacteriumradiobacterAD1[8]和Rhizobiumsp. NHG3[12]。這5種酶又被分A、B和C三個(gè)亞類，亞類內(nèi)的酶序列相似度超過97%，亞類間的相似性卻低于33%，但與SDR家族其他酶具有較高的相似性。

近年來，隨著各類數(shù)據(jù)庫中基因序列的爆發(fā)式增長，通過生物信息學(xué)手段挖掘新酶已成為主要途徑[13]，因而HHDHs酶家族的數(shù)量迅速擴(kuò)增。目前文獻(xiàn)中已報(bào)道的HHDHs達(dá)到77種之多[14-17]，其中已有20多種酶得到詳細(xì)的表征，不同酶的底物譜及立體選擇性都有差異(表1)，大多數(shù)HHDHs脫溴的活力高于脫氯的活力，這是由于C—Cl的鍵能高于C—Br，使得C—Cl不易斷裂；另外，有研究表明HHDHs不能催化C—F斷裂而脫氟[18]。

表1 已表征HHDHs的底物譜及活性

根據(jù)進(jìn)化分析，HHDHs酶家族已由A類擴(kuò)增到G類，共7個(gè)亞類，各亞類之間的HHDHs相似性為25%～45%。HHDHs家族的擴(kuò)增主要集中在A、B、D和E亞類，雖然目前HheC是目前研究最多的亞類，但迄今仍然僅一種(圖2)。目前發(fā)現(xiàn)的HHDHs中，來源于海洋宏基因組的HHDHs集中分布于B類和E類，而其他亞類的HHDHs則多來源于土壤、海洋、污水或淡水淤泥等環(huán)境的細(xì)菌，其中以變形菌門居多。從HHDHs的來源來看，多為鹵素富集區(qū)域，這恰與微生物能夠在含有有毒的鹵代有機(jī)物中利用HHDHs代謝鹵代醇生長繁殖的習(xí)性相適應(yīng)，暫時(shí)還未在其他生物中發(fā)現(xiàn)HHDHs的蹤跡。

圖2 HHDH酶家族進(jìn)化分析

Koopmeiners等[19]在對17種新酶進(jìn)行表征的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，酶的立體選擇性似乎和酶的分類存在著關(guān)聯(lián)，在對2-氯-苯乙醇進(jìn)行脫鹵反應(yīng)時(shí)，B類、E類新酶的立體選擇性為S型，而A類和D類的新酶卻是R型。但是Xue等[14-15]對挖掘的新酶進(jìn)行表征的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，即使同亞類的酶針對同種底物也有不同的立體選擇性。就立體選擇性而言，HheC仍是催化脫鹵反應(yīng)的對映選擇性最高(E>100)的酶[15, 19]。但HheC的熱穩(wěn)定和催化反應(yīng)的最適溫度明顯低于HheA3、HheA5、HheD、HheD3和HheD5[19]，這也是HheC進(jìn)行分子改造時(shí)的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。從新酶的表征數(shù)據(jù)來看，還未發(fā)現(xiàn)HHDHs的分類和功能之間的規(guī)律。

2 HHDHs的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制

HHDHs的活性中心是由Ser-Tyr-Arg構(gòu)成的催化三聯(lián)體，這個(gè)結(jié)構(gòu)與SDR家族非常相似，不同的是SDR家族是Ser-Tyr-Lys[7,9]。通過對已報(bào)道的HHDHs的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，Tyr與Arg之間總被3個(gè)氨基酸隔開[13]，而SDR家族中，超過86%酶的Tyr與Lys之間也相隔3個(gè)氨基酸[6-7]；在HHDHs中，Ser與Tyr之間相隔12個(gè)氨基酸，但SDR家族中Ser與Tyr的相對位置卻不是那么保守[13]。因而由催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)組成的S-X12-Y-X3-R基序被認(rèn)為是辨別HHDHs與SDR家族的重要特征之一(圖3)。此外，HHDHs在N端還擁有1個(gè)含芳香族氨基酸(Phe或Tyr)的寬敞的陰離子結(jié)合口袋，這一結(jié)構(gòu)替代了SDR中富含Ala或Gly的NAD(P)輔酶結(jié)合位點(diǎn)的位置，成為另一個(gè)辨別HHDHs的特征序列T-X4-(F/Y)-X-G[9](圖3)。陰離子結(jié)合口袋通過主鏈上的酰胺鍵形成的氫鍵、芳香族氨基酸殘基帶的正電荷以及水分子的結(jié)合來穩(wěn)定陰離子。雖然在酶的結(jié)構(gòu)中有許多氫鍵供體，但是芳香族的氨基酸殘基能使碳鹵鍵更輕易地?cái)嗔裑23]。

圖3 HHDHs的特征基序

迄今為止，人們已測定了HheA[24]、HheA2[25]、HheB[24]、HheC[9]和HheG[26]的晶體結(jié)構(gòu)，由此發(fā)現(xiàn)，HHDHs是由一對二聚體組成的一個(gè)同源四聚體(圖4)。與SDR家族一樣，HHDHs擁有一個(gè)典型的羅斯曼折疊結(jié)構(gòu)——7個(gè)或者8個(gè)α-螺旋包裹著6個(gè)或7個(gè)平行的β-折疊。雖然酶活性中心在酶的內(nèi)部，但是底物能通過一個(gè)通道與活性中心的氨基酸殘基結(jié)合，通道中的氨基酸殘基則影響HHDHs的底物特異性和產(chǎn)物立體選擇性[27-29]。

圖4 HHDHs的晶體結(jié)構(gòu)

圖5 HHDHs的催化機(jī)制

3 HHDHs的分子改造

野生型酶的催化性能往往無法適應(yīng)工業(yè)化應(yīng)用的需求，隨著定向進(jìn)化等技術(shù)的發(fā)展，通過對HHDHs進(jìn)行酶分子改造以提升其性能是一種重要途徑。HheC在制備阿托他汀藥物前體方面具有很高的價(jià)值，但野生型酶的立體選擇性及酶活力較差。2007年，F(xiàn)ox等[31]首次采用具有革命性的技術(shù)——ProSAR驅(qū)動的定向進(jìn)化技術(shù)，針對HheC催化(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)化為(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的反應(yīng)進(jìn)行分子改造，在眾多的突變體中至少篩選到含有35個(gè)突變體，產(chǎn)物的體積生產(chǎn)率提高了4 000倍左右。在該研究的基礎(chǔ)上，Schallmey等[29]構(gòu)建了含有37個(gè)突變位點(diǎn)的經(jīng)典突變酶HheC-2360，通過酶學(xué)性質(zhì)表征和結(jié)構(gòu)解析研究發(fā)現(xiàn)，HheC-2360催化(S)-氯-3羥基丁酸乙酯脫鹵的kcat提高了3.1倍，在CN-介導(dǎo)下催化(S)-3，4-環(huán)氧丁酸酯開環(huán)的kcat提高了10倍，立體選擇性由HheC的R型轉(zhuǎn)變?yōu)镠heC-2360的S型，并且熱穩(wěn)定性提高了8 ℃。以HheC-2360的晶體結(jié)構(gòu)為模型進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，與產(chǎn)物(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯進(jìn)行分子對接，辨識出關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)，然后對關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，篩選出突變體V84G/W86F，其催化活性比HheC-2360提高了15倍，Km值降低了4/5，kcat增加了3.3倍，使酶與底物的親和性大大提高并擴(kuò)大了酶與底物的結(jié)合空間，產(chǎn)率提高了2倍[32]。此外，HheAAM(HheA12)通過迭代飽和突變后，突變體M4-HheAAM對(3R,5R)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的比酶活達(dá)到了0.89 U/mg，比野生型提高13倍[33]。

另外，提高HheC的穩(wěn)定性也是近年來研究的重要內(nèi)容。湯麗霞團(tuán)隊(duì)的Wu等[34]采用組合定向進(jìn)化的策略，先對野生型HheC進(jìn)行易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變，篩選出6株陽性突變體，共包含8個(gè)突變點(diǎn)，即F12P、D182E、Q87R、N157V、K52E、M252L、F136I和N159R；然后通過迭代飽和突變對這8個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)隨著突變點(diǎn)增加，酶的熱穩(wěn)定性隨之提高，最終篩選擁有8個(gè)突變位點(diǎn)的突變體ISM-4，在未影響其酶活力的前提下，較野生型的酶，其熱穩(wěn)定性大大提高，65 ℃的半衰期提高了3 400倍，tm提高了18 ℃。依據(jù)在HheC的表面選取兩個(gè)相鄰的帶電荷且與活性中心距離不超過1.2 nm的原則，Wang等[35]選取K203和K204兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變?yōu)閹в须姾傻腞、D、E和K，從48個(gè)克隆篩選出CSL1 (K203R)、CSL2(K204R)、CSL3 (K203R/K204R)3個(gè)陽性突變體；與野生型相比，CSL2在55 ℃的半衰期提高了近6.9倍且不影響酶活性，CSL3在55 ℃的半衰期提高了3.4倍，但是其催化1,3-二氯-2-丙醇的kcat值提高了1.8倍；據(jù)動力學(xué)模擬分析，這是由于突變點(diǎn)的氨基酸殘基變化優(yōu)化了蛋白質(zhì)表面電荷間的相互作用和氫鍵作用，使整體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而提高HheC的熱穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的易錯(cuò)PCR等定向進(jìn)化技術(shù)相比，Arabnejad等[36]采用FRESCO方法，通過能量計(jì)算、二硫鍵預(yù)測以及分子動力學(xué)模擬對HheC的突變位點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，不僅使突變后的HheC熱穩(wěn)定性提高了23 ℃，而且耐有機(jī)溶劑；突變體HheC-H12在其最適溫度50 ℃下，其活性是野生型的2倍，在50%甲醇、50%乙腈、25%DMSO、25%二惡烷、25%四氫呋喃和25%二甲基甲酰胺溶液中能維持活性不變，其中在50%乙腈溶液中能保持5 h以上無活性損失，且動力學(xué)常數(shù)和底物范圍與野生型相近；HheC-H12包含了12個(gè)突變點(diǎn)：A29L、D39K、E64R、S68R、Q87R、A93T、C153N、A158V、E190T、E197K、V99I和V236I，其中C153N對穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)最大，它不僅改善了殘基間的相互作用力，還在溶劑間形成穩(wěn)定的氫鍵，它也成為迄今是在穩(wěn)定性方面表現(xiàn)最佳的突變體。

HheG是近年來通過基因挖掘發(fā)現(xiàn)的新酶，對氧化檸檬烯和環(huán)氧環(huán)己具有很高的活性，但是其穩(wěn)定性不佳，限制了它的應(yīng)用。Solarczek等[37]計(jì)算模擬分析HheG的晶體結(jié)構(gòu)，篩選了20個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，最終發(fā)現(xiàn)T123位點(diǎn)的突變體T123G、T123F、T123Y、T123W和T123H的tm不僅提高了7～14 ℃，其酶活力還提高了3倍，其中T123G催化反應(yīng)的初始速度更是提高了5倍。根據(jù)分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，靠近HheG活性位點(diǎn)裂縫位置有一個(gè)快速移動的環(huán)，處于將裂縫部分覆蓋或不覆蓋的狀態(tài)。當(dāng)裂縫部分被覆蓋的時(shí)候，酶活性位點(diǎn)不易于底物接觸，而環(huán)路遷移率和位置直接受123位氨基酸殘基的影響[35]。

4 HHDHs的應(yīng)用

4.1 HHDH制備阿托他汀藥物前體

HHDHs的一個(gè)重要應(yīng)用是催化合成降血脂藥阿托他汀側(cè)鏈基團(tuán)(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。早期研究采用HheC及其突變體[31]和(S)-型酮還原酶聯(lián)合催化下合成了(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。而采用HheA的全細(xì)胞催化 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)化為(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別可達(dá)95%和85%，但是細(xì)胞的消耗較大[38]。后來采用1,3-二氯-2-丙醇為原料，HheC先催化脫鹵并在CN-介導(dǎo)下開環(huán)合成(S)-4-氯-3-羥基丁腈，然后再次脫鹵開環(huán)合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯[39]。在填充柱中填充HHDH固定化酶，連續(xù)催化(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，10 d后底物轉(zhuǎn)化率達(dá)90.6%，經(jīng)過精餾提純可將收率達(dá)到98.2%、純度達(dá)到99.3%、光學(xué)純度達(dá)到99.1%[40]。另外，HheC突變體和腈水解酶AtNIT2共同級聯(lián)催化，可直接將(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)化成(R)-3-羥基戊二酸，更有利于后續(xù)阿托伐他汀側(cè)鏈基團(tuán)的合成[41]。因?yàn)?R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯作為中間體合成阿托伐他汀的路徑需要-78 ℃的極端條件，Luo等[32]便改進(jìn)了路徑，利用HheC2360-V84G/W86F催化(3S,5R)-6-氯-3,5-二羥基已酸叔丁酯轉(zhuǎn)化為(3S,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯，從而避免了原先路線后續(xù)的苛刻反應(yīng)條件。

4.2 HHDH制備環(huán)氧氯丙烷

4.3 HHDH在生物催化其他方面的應(yīng)用

5 總結(jié)和展望

HHDHs因其既能催化鄰鹵代醇脫鹵成環(huán)，又能催化環(huán)氧化物開環(huán)的特殊機(jī)制，使其成為生物催化領(lǐng)域一種重要的生物催化劑。它不僅可用于降解鹵代有機(jī)污染物，還可廣泛應(yīng)用于降脂藥阿托伐他汀前體、環(huán)氧氯丙烷以及其他環(huán)氧化物、β-取代醇等化合物的制備。它的催化三聯(lián)體構(gòu)成的基序S-X12-Y-X3-R以及N端的陰離子口袋構(gòu)成的基序T-X4-(F/Y)-X-G是辨識HHDH序列的兩個(gè)重要特征，也是基于數(shù)據(jù)庫挖掘新酶篩選的標(biāo)志。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，生物信息數(shù)據(jù)庫中基因數(shù)據(jù)呈現(xiàn)爆炸式的增長，通過HHDHs序列特征在數(shù)據(jù)庫中挖掘新的HHDHs是當(dāng)前的主要方向。可以預(yù)計(jì)未來會有更多的HHDHs家族其他成員被挖掘出來，不斷拓展HHDHs的來源。

從目前已表征的酶來看，野生型酶的穩(wěn)定性和立體選擇性不佳，很難滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。通過ProSAR驅(qū)動的定向進(jìn)化技術(shù)、易錯(cuò)PCR、迭代飽和突變、FRESCO法等方法對酶分子改造，HHDH的穩(wěn)定性和立體選擇性均有顯著提高。隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的快速發(fā)展，定向進(jìn)化技術(shù)越來越成熟以及相應(yīng)的高通量篩選設(shè)備來越先進(jìn)，預(yù)計(jì)未來將改造出更多具有優(yōu)異性能的HHDHs，以滿足工業(yè)過程的需要。另外，酶固定化技術(shù)也提升了HHDHs的催化性能，使HHDH可以回收，多次重復(fù)利用，在生物反應(yīng)器中，可連續(xù)性操控生物催化反應(yīng)，更加適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

由于脫鹵反應(yīng)進(jìn)行高通量篩選HHDHs的顯色試劑以及開環(huán)反應(yīng)所需的親核試劑多為劇毒、易制爆藥品，普通實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施難以滿足條件，一定程度上阻礙了HHDHs的快速發(fā)展。開發(fā)安全便捷的分析方法也將是研究HHDHs的重要內(nèi)容。

隨著酶工程技術(shù)越來越成熟以及高通量篩選等設(shè)備越來越先進(jìn)，基于數(shù)據(jù)庫挖掘新酶，通過分子改造及固定化等技術(shù)獲取更多能夠滿足工業(yè)需求的HHDHs，完善HHDH生物催化的工藝條件將成為研究人員未來關(guān)注的焦點(diǎn)，預(yù)計(jì)未來將有許多可適應(yīng)醫(yī)藥化工等行業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)需求的HHDH商業(yè)酶產(chǎn)品。