Tmprss6基因對小鼠放射性腸損傷的影響

毛久昂，翁 震，鈕曉音，何 楊，王振欣#

1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，蘇州 215006；2.蘇州大學血液和血管疾病診療藥物技術教育部工程研究中心，蘇州 215123；3.上海交通大學醫(yī)學院，上海市免疫學研究所，上海 200025；4.江蘇省血液研究所，蘇州大學附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006

小腸上皮持續(xù)、快速更新的特點決定了其對電離輻射具有高度敏感性［1］。目前，放射治療（放療）是癌癥的一線治療手段，但輻照引起的腸損傷嚴重影響腫瘤患者生存質量，是放療應用領域亟待解決的問題［2］。糾正腸道氧化應激狀態(tài)是治療放射性腸損傷的重要手段［3］。有證據［4-5］表明，高鐵會增加輻照后細胞清除活性氧的負擔，從而增強細胞對放射的敏感性并加重放射損傷。小腸是鐵吸收的主要器官，但其不同部位鐵代謝特點與放射性腸損傷的關系仍不明確。

Tmprss6基因編碼的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶Matriptase2是肝臟表達的膜錨定蛋白，通過結合并抑制鐵調素調節(jié)蛋白抑制鐵調素表達，從而參與調控鐵代謝［6］。鐵調素是肝臟分泌的一種肽類激素，結合并降解腸上皮細胞和巨噬細胞膜上的膜鐵轉運蛋白1 （ferroportin 1，FPN1）阻斷細胞內鐵向血液中輸出，可在維持哺乳動物系統(tǒng)性鐵穩(wěn)態(tài)中起核心作用。機體鐵缺乏和炎癥狀態(tài)可以誘導鐵調素的表達增加［7］。本研究旨在觀察Tmprss6基因在放射性腸損傷中的作用并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染料、蛋白酶K、抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）均購自上海碧云天生物技術有限公司；Triton X-100 購自Sigma Aldrich（中國），TUNEL 熒光染色法細胞凋亡檢測試劑盒和檸檬酸鈉溶液購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

正置光學顯微鏡（DM3000，德國徠卡），共聚焦熒光顯微鏡（FV3000，日本奧林巴斯），電感耦合等離子體質譜儀（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS，美國賽默飛），生物學X 射線輻照儀（XRAD320ix，美國PXi）。

1.2 實驗動物

雄性7～8周齡野生型（wild type，WT）和Tmprss6基因敲除（Tmprss6-/-）C57BL/6 小鼠（體質量20～22 g）購自北京維通利華公司。以C57BL/6 為背景的Tmprss6-/-小鼠為賽業(yè)（蘇州）科技有限公司構建。動物生產許可證號為SCXK （京） 2019-0001，使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0043。小鼠均飼養(yǎng)于蘇州大學實驗動物中心SPF級動物房。本實驗方案通過蘇州大學實驗動物倫理委員會審查（審批號201810A530）。

1.3 放射性腸損傷模型建立及分組

將Tmprss6-/-小鼠和WT小鼠各自隨機分為未輻照組以及輻照后6 h、24 h、3.5 d、7 d組，每組各10只。輻照組小鼠于輻照前腹腔注射5%水合氯醛麻醉，隨后將全腹部暴露于X射線源下，照射距離50 mm，劑量率1.5 Gy/min，吸收劑量為11.5 Gy。未輻照組給予相同劑量5%水合氯醛且不予輻照。通過TUNEL法檢測未輻照及輻照后6、24 h小鼠十二指腸、回腸隱窩細胞凋亡情況；通過H-E染色觀察未輻照及輻照后3.5 d小鼠十二指腸、回腸組織學變化；對未輻照及輻照后3.5、7 d小鼠的十二指腸、回腸組織進行鐵含量和抗氧化指標檢測。

1.4 組織學和形態(tài)分析

于11.5 Gy 全腹部照射（total abdominal X-ray irradiation，TAI）后第3.5 日處死小鼠。自胃竇下緣5 mm切取1 cm腸段為十二指腸，盲腸袋上緣5 mm切取1 cm腸段為回腸，4%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，制成4 μm薄片，常規(guī)流程脫蠟、水合并進行H-E染色。光學顯微鏡下采集圖像，并以盲法將圖像數字編碼。使用ImageJ 1.52軟件測量絨毛長度，計算每1 mm周長隱窩個數。

1.5 小腸隱窩細胞凋亡檢測

取TAI 后6 、24 h 小鼠十二指腸及回腸，制作組織切片。組織切片脫蠟、水合，滴加20 μg/mL 蛋白酶K，37 ℃孵育20 min 后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 浸潤清洗3 次，每次5 min；滴加適量0.1% Triton X-100/0.1%檸檬酸鈉破膜液覆蓋組織，室溫孵育20 min 后PBS 浸潤清洗3 次，每次5 min。采用TUNEL 熒光染色法，依照產品說明書處理組織切片，最后使用抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）進行封片。采用共聚焦熒光顯微鏡檢測小腸凋亡細胞，200 倍視野下采集隱窩圖像，ImageJ 1.52 軟件統(tǒng)計每個隱窩凋亡細胞數。

1.6 鐵含量及氧化應激指標的測量

將輻照后0、3.5、7 d 的小鼠十二指腸和回腸組織凍干，取3 mg 小腸組織在65%的濃硝酸中消化過夜。加熱除去硝酸后，加入1%硝酸將體積定容到1 mL，ICP-MS測定組織中鐵濃度。各組小腸組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量由南京建成生物工程研究所檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以±s表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。相關性分析采用Spearman 相關性檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠十二指腸損傷及細胞凋亡

輻照前的Tmprss6-/-小鼠與WT 小鼠十二指腸絨毛長度、平均每毫米橫截面隱窩計數比較，差異均無統(tǒng)計學意義。在輻照后3.5 d，Tmprss6-/-和WT小鼠十二指腸絨毛長度均縮短，平均每毫米橫截面隱窩計數均減少；Tmprss6-/-小鼠的十二指腸絨毛長度和隱窩計數低于WT小鼠（均P＜0.05）（圖1A～C）。

圖1 Tmprss6-/-小鼠與WT小鼠行TAI后十二指腸損傷和細胞凋亡情況的比較Fig 1 Comparison of duodenal injury and apoptosis between Tmprss6-/-mice and WT mice after TAI

輻照后6 和24 h，Tmprss6-/-小鼠十二指腸段每隱窩TUNEL 染色陽性細胞數相較于WT 小鼠顯著增多（均P＜0.05）（圖1D、E）。

2.2 小鼠回腸損傷及細胞凋亡情況

輻照前的Tmprss6-/-與WT 小鼠回腸絨毛長度及平均每毫米橫截面隱窩計數比較，差異均無統(tǒng)計學意義。輻照后3.5 d，Tmprss6-/-小鼠回腸絨毛長度和隱窩計數相較于WT小鼠均顯著升高（均P＜0.05）（圖2A～C）。

輻照后6 和24 h，Tmprss6-/-小鼠回腸段每隱窩TUNEL 染色陽性細胞數相較于WT 小鼠顯著減少（均P＜0.05）（圖2D、E）。

圖2 Tmprss6-/-小鼠與WT小鼠行TAI后回腸損傷和細胞凋亡情況的比較Fig 2 Comparison of ileum injury and apoptosis between Tmprss6-/-mice and WT mice after TAI

2.3 小鼠輻照后不同腸段鐵含量的變化

輻照后，2種基因型小鼠十二指腸和回腸鐵含量均增加；其中WT 小鼠輻照后3.5 d 與輻照前的差異有統(tǒng)計學意義，Tmprss6-/-小鼠輻照后7 d與輻照前的差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖3）。輻照前后，Tmprss6-/-小鼠十二指腸鐵含量均顯著高于同時間點的WT 小鼠（均P＜0.05）（圖3A）。輻照前及輻照后3.5、7 d 時，Tmprss6-/-小鼠回腸部位的鐵含量與WT小鼠比較，差異均無統(tǒng)計學意義（圖3B）。

圖3 WT和Tmprss6-/-小鼠行TAI后不同腸段鐵含量的變化Fig 3 Iron concentration of different intestine segments in WT and Tmprss6-/-mice after TAI

2.4 小鼠輻照后不同腸段抗氧化相關指標的變化

輻照后3.5 d和7 d，Tmprss6-/-小鼠十二指腸部位SOD、GSH、T-AOC水平相較于WT小鼠均下降，而MDA水平則升高；在輻照后3.5 d，SOD、GSH、T-AOC 和MDA 的差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4）。輻照后3.5 d和7 d，Tmprss6-/-小鼠回腸段SOD、GSH和T-AOC水平相較于WT小鼠均升高，MDA則降低；在輻照后3.5 d，GSH、T-AOC和MDA水平的差異具有統(tǒng)計學意義；在輻照后7 d，SOD水平的差異才具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖5）。

圖4 WT和Tmprss6-/-小鼠行TAI后十二指腸段抗氧化指標的變化Fig 4 Antioxidant index changes of duodenums in WT and Tmprss6-/-mice after TAI

圖5 WT和Tmprss6-/-小鼠行TAI后回腸段抗氧化指標的變化Fig 5 Antioxidant index changes of ileums in WT and Tmprss6-/-mice after TAI

2.5 鐵含量與抗氧化指標的相關性

將所有小鼠輻照后各時間點不同腸段的鐵含量與抗氧化指標進行相關性分析，結果顯示：輻照后，小鼠腸組織MDA 和SOD 水平與其鐵含量相關，但在輻照前（0 d）無相關性（表1）。

表1 輻照前后小腸T-AOC、MDA、SOD和GSH水平與鐵含量的相關性分析Tab 1 Correlation analysis of the levels of T-AOC,MDA,SOD and GSH and iron content in small intestines before and after irradiation

小鼠十二指腸段MDA、SOD和T-AOC水平與其鐵含量相關，回腸段GSH、SOD 和T-AOC 水平與其鐵含量相關（圖6）。

圖6 小鼠小腸組織鐵含量與抗氧化指標的相關性分析Fig 6 Correlation analysis of iron content and antioxidant indexes of mice intestines

分別對照射后WT 小鼠和Tmprss6-/-小鼠進行相關性分析，結果顯示：WT 小鼠十二指腸段的MDA 和SOD 水平與其鐵含量相關，回腸段T-AOC、MDA和GSH水平與其鐵含量相關（圖7）；Tmprss6-/-小鼠十二指腸段MDA、SOD 和T-AOC 水平與其鐵含量相關，但回腸段各抗氧化指標與鐵含量均無相關性（圖8）。

圖7 WT小鼠小腸鐵含量與抗氧化指標相關性分析Fig 7 Correlation analysis of iron content and antioxidant indexes of intestines in WT mice

圖8 Tmprss6-/-小鼠小腸鐵含量與抗氧化指標相關性分析Fig 8 Correlation analysis of iron content and antioxidant indexes of intestines in Tmprss6-/-mice

3 討論

放療是癌癥的主要治療方式之一。在全球范圍內，約有50%的癌癥患者有放療需求［8］。小腸是盆腔部放療最易受到影響的部位，盆腔部放療可引起胃腸道癥狀，包括腹瀉、直腸出血和大便失禁［9］，嚴重影響放療患者的生存質量，也限制了放療的應用。電離輻射誘導多種自由基產生，進一步導致氧化還原系統(tǒng)失衡，是早期和晚期放射性腸損傷的重要原因［10］。因此，清除自由基是減輕放射性腸損傷重要的手段之一。本研究發(fā)現Tmprss6基因敲除導致十二指腸鐵累積和電離輻射后氧化應激負擔加重，加劇了十二指腸的放射損傷。同時，也在Tmprss6-/-小鼠的回腸中觀察到放射損傷緩解的現象。十二指腸和回腸段放射損傷情況的對比結果提示，Tmprss6基因在放射性腸損傷中發(fā)揮復雜的調控作用。

本研究中，TAI后小鼠十二指腸和回腸均出現不同程度的鐵累積，并且在十二指腸更為顯著，可能與十二指腸的鐵吸收特性相關。有研究［7］表明，與放射后腸道損傷相關的炎癥反應誘導鐵調素升高，可以促使鐵螯合在細胞內部，進一步解釋了輻照后腸道鐵累積現象。Tmprss6基因編碼的Matriptase2 是鐵調素的關鍵抑制劑［6］。鐵調素結合并降解巨噬細胞和十二指腸上皮細胞基底膜上的FPN1，抑制細胞內鐵向血液中轉運，可將鐵螯合在細胞內［11］。本研究觀察到Tmprss6-/-小鼠輻照前后十二指腸鐵含量較WT小鼠均顯著增高，這一現象與其鐵調素基礎水平高的特點相一致；然而，Tmprss6-/-小鼠回腸鐵含量與WT小鼠相比并無顯著差異。該結果提示，十二指腸是Tmprss6基因調控小腸鐵含量的主要部位。

細胞呼吸、氧氣轉運和DNA 合成等基礎生理過程都依賴于鐵的氧化還原特性，但過量的鐵可通過Fenton 反應產生羥自由基（·OH）等活性氧誘導氧化應激，導致DNA 損傷和細胞凋亡［12］。高鐵飲食是增加腸道氧化應激壓力的獨立因素［13］，同時有證據表明高鐵飲食會增加輻照后細胞清除活性氧的負擔，從而增強細胞放射敏感性，加重放射損傷［4-5］。電離輻射通過分解細胞內的水，迅速產生·OH、電離水和超氧陰離子（O2-·）等多種活性氧，間接造成DNA、脂質、蛋白質等內源性細胞成分氧化損傷，是導致放射性損傷的主要原因［10，14］。70%的DNA 損傷歸因于這種由活性氧介導的間接損傷效應，而·OH 在其中發(fā)揮主要作用。30%的·OH 可直接與DNA 核糖部分或通過磷酸基反應誘導DNA 單鏈或雙鏈斷裂。此外，·OH 可通過與多不飽和脂肪酸反應介導脂質過氧化。脂質過氧化產物分解產生含有反應性碳基的分子，如MDA，可作為脂質過氧化的標志物。細胞內氧化還原平衡由SOD、GSH 等多種抗氧化酶和非酶類化合物調節(jié)，這些化合物在細胞內的水平可以反映其抗氧化活力［15-16］。本研究對輻照前后小鼠小腸SOD、GSH、MDA 和T-AOC 與對應的小腸鐵含量進行了相關性分析，結果發(fā)現，輻照后7 d，小鼠小腸氧化應激水平與其鐵含量顯著相關。這一結果提示，小腸組織輻照后鐵含量增加可能是放射性腸損傷的危險因素。Tmprss6-/-小鼠十二指腸段鐵含量的顯著升高，可能是其放射性損傷加重的重要原因。

此外，輻照后腸屏障功能低下，細菌移位可以增加輻照后腸道并發(fā)癥的風險。Bessman 等［17］研究發(fā)現，腸道樹突狀細胞來源的鐵調素作用于表達FPN1 的巨噬細胞，使其螯合腸腔內鐵，阻斷了腸道有毒微生物的鐵來源，可以促進腸道黏膜修復。本研究結果顯示，回腸并非Tmprss6基因調控小腸鐵含量的主要部位，輻照前后Tmprss6-/-小鼠回腸鐵含量與WT 小鼠并無顯著差異。Tmprss6-/-小鼠回腸段放射防護現象可能得益于其鐵調素的高表達，未來的研究有必要進一步探索鐵調素在放射相關的腸道炎癥與菌群紊亂中的作用。

本研究使用放射腸損傷模型初步探討了Tmprss6基因敲除在腸道放射損傷中的作用，發(fā)現Tmprss6基因在不同腸段放射性腸損傷的調控中發(fā)揮不同的作用，并揭示了小腸鐵含量與輻照誘導的氧化應激的相關性，為進一步探索鐵或鐵調素在放射性腸損傷中的作用提供參考。此外，本研究尚存在一些局限性，并未探討血清鐵水平對局部輻照腸損傷的影響，并且電離輻射對腸道鐵代謝的調節(jié)機制仍需進一步研究。