淫羊藿苷對cuprizone誘導(dǎo)精神分裂癥樣小鼠模型行為學(xué)變化、髓鞘脫失及神經(jīng)炎性反應(yīng)的影響

陳 溪 馬登磊 李 林*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心，北京 100053； 2. 北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué)藥學(xué)系，北京 100079)

精神分裂癥是以認(rèn)知力和情感深度分裂為特征的一種疾病，表現(xiàn)為最基本的人類行為受到影響，例如語言、思想、知覺和自我感知等，全球范圍內(nèi)患病率約為1%，嚴(yán)重影響患者及家人的生活[1]。該疾病癥狀主要包括有陽性癥狀、陰性癥狀以及認(rèn)知方面的障礙。陽性癥狀包括幻想、錯覺、思維紊亂以及行為怪誕；陰性癥狀包括行為動機低下、情感反應(yīng)淡漠、失語癥以及興奮能力低下。同時，大多數(shù)的精神分裂癥患者都有認(rèn)知能力損傷的癥狀，主要是與處理任務(wù)的信息缺失有關(guān)[2]。

白質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是神經(jīng)纖維聚集的地方，中樞神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘損害，會引起白質(zhì)病變。精神分裂癥患者出現(xiàn)白質(zhì)神經(jīng)纖維的異常，如髓鞘的變化、軸突的紊亂等，而且多發(fā)性硬化等脫髓鞘疾病可出現(xiàn)精神障礙癥狀。研究[3]顯示，神經(jīng)白質(zhì)病變與精神障礙和一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone)是一種銅離子螯合劑，能夠螯合銅離子從而導(dǎo)致銅離子依賴的一系列酶如線粒體酶、細(xì)胞色素氧化酶以及單胺氧化酶等被抑制，從而選擇性誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞(髓鞘形成細(xì)胞)凋亡，引發(fā)髓鞘脫失[4]。若連續(xù)以含0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))cuprizone飼料飼喂小鼠5～6周，小鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，而且腦內(nèi)胼胝體部位的髓鞘會出現(xiàn)脫失[5]。該模型具有病程易控制，重現(xiàn)性高等特點，已用于抗精神分裂癥藥物的研究[6-7]。

研究[8]顯示，炎性反應(yīng)和免疫功能異?？赡芘c精神分裂癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。在精神分裂癥患者和具有精神分裂高風(fēng)險的患者大腦內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞更活躍，表明神經(jīng)炎性反應(yīng)是精神分裂的一個重要因素，并成為治療和預(yù)防精神分裂癥的一個新的潛在目標(biāo)。長期暴露于慢性不可預(yù)知性應(yīng)激也可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的形狀及功能發(fā)生改變，而這種應(yīng)激及其誘發(fā)的炎性反應(yīng)同樣也是導(dǎo)致人類出現(xiàn)精神障礙的最首要原因之一[9]。

淫羊藿是我國常用的經(jīng)典中藥，具有溫陽補腎、強筋健骨、祛風(fēng)除濕等功效。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，具有很好的抗炎作用[10]。筆者[11]前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠改善N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗劑MK-801致精神分裂癥小鼠模型的陰性癥狀和陽性癥狀。本研究擬應(yīng)用cuprizone致脫髓鞘小鼠模型，研究淫羊藿苷對精神分裂癥樣行為學(xué)變化、腦白質(zhì)部位髓鞘脫失及神經(jīng)炎性反應(yīng)的影響，為抗精神分裂癥新藥的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

淫羊藿苷(icariin，ICA)，高效液相色譜 (high performance liquid chromatography，HPLC)檢測純度為99.09%，購自陜西寶雞市辰光生物科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組

C57BL/6雄性小鼠，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級，購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號：11400700106244。小鼠采用數(shù)字表法隨機分為正常對照組、模型組、模型+ICA低劑量(25 mg/kg)和高劑量(50 mg/kg)組，每組8只。

1.3 動物造模方法

先適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境3 d，然后除了對照組給予正常飼料以外，其他各組均喂飼含0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))cuprizone的飼料進(jìn)行造模。造模的同時各組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，每日一次，連續(xù)5周，然后進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.4 Y-迷宮試驗

Y迷宮由3個完全相同的臂組成。Y-迷宮試驗的進(jìn)臂次數(shù)可反映小鼠的活動情況，自發(fā)性交替反應(yīng)率可反映小鼠的空間工作記憶情況。自發(fā)性交替反應(yīng)(alternation)檢測方法：將小鼠放在一個臂的末端，記錄8 min內(nèi)動物進(jìn)入各個臂的順序。Alternation被定義為連續(xù)進(jìn)入3個臂(如1，2，3或1，3，2)，最大alternation 為進(jìn)臂次數(shù)的總和-2，然后計算：自發(fā)性交替反應(yīng)率(%)=實際的alternation/最大alternation×100%。

1.5 曠場試驗

曠場試驗(open field test)的設(shè)備由曠場反應(yīng)箱、數(shù)據(jù)自動采集和處理系統(tǒng)組成。曠場反應(yīng)箱底邊長72 cm，高25～30 cm，內(nèi)壁為黑色，底面平均劃分為64個小方格。正上方架一數(shù)碼攝像頭，拍攝范圍覆蓋整個曠場內(nèi)部。首先將小鼠放入曠場反應(yīng)箱內(nèi)中心區(qū)域，同時開始進(jìn)行攝像和計時。記錄小鼠10 min內(nèi)的自發(fā)活動總距離，距離越長表示活動性越高，可反映精神分裂癥高活動性陽性癥狀。

1.6 動物腦組織取材與切片

小鼠麻醉后分別灌注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)及4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定液。固定后取出腦組織。脫水后在冰凍切片機(美國Thermo公司)中行冠狀位冰凍切片，切片厚度為40 μm。

1.7 油紅O染色

冰凍切片提前切片，呈于載玻片上，稍做晾干。把晾干的載玻片放在盛有水的濕盒中，保持環(huán)境濕潤。配制油紅O工作液，靜止10 min后過濾使用，建議過濾兩次染色效果更佳。用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇分色1 min，流水漂洗1 min。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核15 s左右。鹽酸乙醇分色20 s，流水清洗1 min。放置稍做晾干，切不可太過干燥，甘油明膠封片。

1.8 免疫組織化學(xué)方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)表達(dá)、Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞和GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞。小鼠腦冰凍切片提前切片，置于載玻片上，10%(體積分?jǐn)?shù))血清封閉。室溫封閉2 h 后，分別孵育一抗：兔抗MBP抗體(1∶2 000稀釋，美國Sigma公司)、抗Iba-1抗體(1∶500稀釋，日本W(wǎng)ako公司)、抗GFAP抗體(1∶100稀釋，美國Santa Cruz公司)，4 ℃過夜。PBST洗去一抗后，加入二抗(生物素結(jié)合的羊抗兔IgG抗體，1∶100稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)及三抗(辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素抗體，1∶100稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。PBST漂洗后用DAB顯色液進(jìn)行顯色(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。脫水，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察和拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對cuprizone模型小鼠行為學(xué)變化的影響

2.1.1 Y迷宮試驗

與對照組相比，cuprizone模型小鼠的進(jìn)臂次數(shù)略有增高，ICA(25、50 mg/kg)灌胃給藥5周顯著減低了模型小鼠的進(jìn)臂次數(shù)(P<0.01，圖1A)。此外，模型小鼠的自發(fā)性交替反應(yīng)率明顯減低(P<0.01)，ICA(25 mg/kg)給藥可以明顯增高模型小鼠的自發(fā)性交替反應(yīng)率(P<0.05，圖1B)。

圖1 淫羊藿苷對cuprizone模型小鼠Y-迷宮試驗的影響Fig.1 Effect of icariin (ICA) on Y-maze test in cuprizone model miceA: arm entrance; B: percentage of alternation behavior；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs model group；##P<0.01 vs control group.

2.1.2 曠場試驗

與對照組相比，cuprizone模型小鼠10 min內(nèi)的自發(fā)活動總距離顯著延長(P<0.01)，ICA(25、50 mg/kg)灌胃給藥能夠明顯縮短模型小鼠的自發(fā)活動總距離(P<0.05,圖2)。

圖2 ICA對cuprizone模型小鼠自發(fā)活動總距離的影響(曠場試驗)Fig.2 Effect of ICA on the total distance of spontaneous activity in cuprizone model mice (open field test)##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

2.2 ICA對cuprizone模型小鼠胼胝體部位髓鞘脫失的影響

2.2.1 油紅O染色

正常對照組小鼠胼胝體著色面積廣，著色程度高，而cuprizone模型組的著色面積和著色程度都顯著

降低。灌胃給予ICA(25、50 mg/kg)能夠顯著增加模型小鼠胼胝體的油紅O著色面積和著色程度(圖3)。

2.2.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)法檢測腦內(nèi)MBP的表達(dá)。與正常對照組相比，cuprizone模型組小鼠胼胝體部位MBP表達(dá)明顯降低。ICA(25、50 mg/kg)能夠顯著升高模型小鼠腦內(nèi)MBP表達(dá)(圖4)。

2.3 ICA對cuprizone模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)的影響

2.3.1 小膠質(zhì)細(xì)胞

采用免疫組織化學(xué)方法檢測以Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞。與正常對照組相比，cuprizone模型組小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)；ICA(50 mg/kg)灌胃給藥能夠明顯減少模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01,圖5)。

圖5 ICA對cuprizone模型小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響Fig.5 Effect of ICA on microglia activation in the corpus callosum of cuprizone model miceA: representative immunohistochemical images, microglia labeled with Iba-1. Scale bar=50 μm; B: number of microglia. ##P<0.01 vs control group，**P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

2.3.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞

采用免疫組織化學(xué)方法檢測以GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞。與正常對照組相比，cuprizone模型組小鼠胼胝體部位星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)。 ICA(50 mg/kg)灌胃給藥能夠明顯減少模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01，圖6)。

圖6 ICA對cuprizone模型小鼠胼胝體部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響Fig.6 Effect of ICA on astrocytes in the corpus callosum of cuprizone model miceA: representative immunohistochemical images, astrocytes labeled with GFAP. Scale bar=50 μm. B: number of astrocytes. ##P<0.01 vs control group，**P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

3 討論

Cuprizone介導(dǎo)的脫髓鞘模型在胼胝體、海馬、嗅球、視交叉、腦干、小腦、紋狀體、皮質(zhì)、扣帶回等腦區(qū)可見到明顯的脫髓鞘病灶[12]?；诒灸Ｐ托∈笮袨閷W(xué)改變以及病理改變與精神分裂癥患者具有一致性，使得cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘模型成為研究精神分裂癥白質(zhì)損傷及治療研究的動物模型[13]。

Y-迷宮試驗和曠場試驗是用來評價精神分裂癥動物模型行為學(xué)變化的常用方法[14]。Y-迷宮的自發(fā)交替行為可用于檢測精神分裂癥模型小鼠的空間工作記憶能力(反映認(rèn)知功能)，進(jìn)臂次數(shù)檢測模型小鼠的高活動性(反映陽性癥狀)。曠場試驗的活動總距離亦可用于檢測精神分裂癥模型小鼠的高活動性(反映陽性癥狀)[4]。本研究結(jié)果顯示，cuprizone模型小鼠在Y-迷宮試驗中的自發(fā)交替反應(yīng)率降低，反映出記憶功能減退；在曠場試驗中的活動總距離延長，反映出高活動性陽性癥狀，表明模型成功模擬了精神分裂癥的癥狀。對模型小鼠給予ICA，能夠顯著增高Y-迷宮試驗的自發(fā)性交替反應(yīng)率，并減少Y-迷宮試驗的進(jìn)臂次數(shù)、縮短曠場試驗中的活動總距離，表明ICA能夠明顯改善模型小鼠的記憶功能障礙和高活動性陽性癥狀，提示ICA具有抗精神分裂癥潛能。由于目前臨床缺乏改善認(rèn)知障礙的抗精神病藥物，ICA的改善記憶作用尤其值得關(guān)注。

大腦白質(zhì)位于皮質(zhì)深面，有髓神經(jīng)纖維是大腦白質(zhì)的主要組成部分，有髓纖維由髓鞘及其包覆的神經(jīng)軸突構(gòu)成。近年來，隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，軸突損傷造成的各腦區(qū)間聯(lián)系紊亂成為精神分裂癥病因?qū)W的重要假說[15]。磁共振-彌散張量成像研究[1,3]顯示，精神分裂癥患者腦內(nèi)白質(zhì)體積減小，出現(xiàn)髓鞘脫失、軸突紊亂等白質(zhì)纖維的異常，提示髓鞘病變與精神分裂癥的發(fā)病機制密切相關(guān)。髓鞘損傷可造成高級認(rèn)知功能障礙，進(jìn)而影響患者的認(rèn)知功能。MBP是軸突髓鞘化的標(biāo)志性蛋白，是髓鞘的主要組成成分。研究[16]顯示，精神分裂癥患者大腦前額葉皮質(zhì)存在MBP等髓鞘形成相關(guān)蛋白的低表達(dá)。本研究采用油紅O染色和MBP免疫組織化學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)cuprizone模型小鼠腦白質(zhì)胼胝體部位出現(xiàn)明顯的髓鞘脫失，MBP表達(dá)減少，該結(jié)果與Zhang等[17]的報道一致。而ICA能夠明顯改善模型小鼠胼胝體部位的髓鞘脫失狀況，增高M(jìn)BP的表達(dá)，這可能是ICA改善cuprizone模型小鼠行為學(xué)變化的重要機制之一。

近年來的證據(jù)[18]表明，炎性反應(yīng)及免疫功能異常很可能與精神分裂癥的發(fā)病有密切關(guān)系。圍產(chǎn)期的感染是精神分裂癥的高發(fā)因素，對圍產(chǎn)期的小鼠注射細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)能夠作為精神分裂癥動物模型的造模手段，也為炎性反應(yīng)參與精神分裂癥的發(fā)生提供了有力的證據(jù)。炎性反應(yīng)可以通過能夠抑制神經(jīng)發(fā)生、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、抑制髓鞘的形成等，參與精神分裂癥的機制。同時，臨床研究[19]的結(jié)果也顯示抗炎藥物能夠改善精神分裂癥患者的部分癥狀，進(jìn)而使精神分裂癥的炎性反應(yīng)假說受到關(guān)注。本研究中，cuprizone模型小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多。ICA能夠明顯減少模型小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，抑制炎性細(xì)胞活化。結(jié)果提示，ICA的抗神經(jīng)炎性反應(yīng)作用可能是其治療精神分裂癥的作用機制之一。

綜上所述，對于cuprizone誘導(dǎo)的精神分裂癥模型小鼠，ICA能夠改善高活動性陽性癥狀和認(rèn)知功能障礙，并能夠改善髓鞘脫失的病理改變，拮抗神經(jīng)炎性反應(yīng)，可能成為具有抗精神分裂癥潛能的候選藥物。