IL-6、TNF-α、GR-α、GR-β mRNA與常見眼眶疾病患者對(duì)糖皮質(zhì)激素敏感性的關(guān)系

趙 珂 馬建民 肖 飛 劉向祎*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科, 北京 100730; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京同仁眼科中心, 北京市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730； 3. 衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730； 4. 北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730)

眼眶病種類繁多，包括炎癥、腫瘤和外傷等。甲狀腺相關(guān)性眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)及特發(fā)性眼眶炎性假瘤(idiopathic orbital pseudotumor, IOIP)的發(fā)病率分別居于常見眶內(nèi)病變的第一位和第三位[1]。TAO是一種自身免疫性、器官特異性的慢性炎癥，在眶內(nèi)疾病中發(fā)病率約20%[2]。常見的臨床體征有眼球突出、眼瞼回縮、上瞼遲落、復(fù)視、眼球活動(dòng)受限及眼肌受累等。IOIP是一種特發(fā)性、良性、發(fā)病外觀類似腫瘤的非特異性眼眶炎癥。其發(fā)病率約占眶內(nèi)疾病的7.1%～12.3%，通常為單眼發(fā)病，也有8%～20%的患者雙側(cè)同時(shí)或者依次發(fā)病[1]。疼痛、眼球突出、眼瞼腫脹及眼壓升高是其主要臨床表現(xiàn)。

TAO及IOIP兩種疾病的一線用藥為糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)。長期或者大量應(yīng)用GC會(huì)引起眾多的不良反應(yīng)，如高血糖、高血壓及骨質(zhì)疏松等[3]。研究[4]表明，長期使用相當(dāng)于5 mg/d強(qiáng)的松劑量的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較低，但使用劑量>10 mg/d時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)明顯增加，這極大影響了患者服藥的依從性。同時(shí)，糖皮質(zhì)激素抵抗(glucocorticoid resistance,GCR)的現(xiàn)象也引起了人們更多的關(guān)注。GCR多為后天獲得，且在不同疾病中發(fā)生率和發(fā)病機(jī)制不同[5]。GCR的產(chǎn)生可能與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)親和力降低、數(shù)量減少、炎癥因子的調(diào)控及GC作用通路上其他的轉(zhuǎn)錄因子水平和功能變化等有關(guān)。目前，這些研究多集中于哮喘、過敏性鼻炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，而關(guān)于TAO及IOIP患者對(duì)GC敏感性的研究卻很少。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是典型的促炎因子，均具有免疫調(diào)節(jié)活性[6-7]。研究[8]表明，在活動(dòng)期TAO患者的眼眶組織中，觀測到IL-6及TNF-α的濃度明顯升高。但是關(guān)于IL-6及TNF-α濃度和患者對(duì)GC敏感性是否一致尚未有定論。本研究旨在探討IL-6、TNF-α、GR-α及GR-β mRNA與常見眼眶疾病如TAO和IOIP患者糖皮質(zhì)激素敏感性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年12月5日至2020年12月22日在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院眼腫瘤門診就診的TAO患者62例(其中對(duì)GC敏感組45例，抵抗組17例)和IOIP患者36例(對(duì)GC敏感組有25例，抵抗組11例)為研究對(duì)象。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：TRECKY2019-112)。

1.1.1 TAO患者的納入和分組標(biāo)準(zhǔn)

TAO患者納入標(biāo)準(zhǔn)參照Bartley的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。若有眼瞼退縮者,只要合并以下體征或檢查證據(jù)任意其中一項(xiàng)，即可確診TAO：(1)甲狀腺功能亢進(jìn)；(2)眼球突出或雙眼球突度相差大于2 mm；(3)眼外肌受累,眼球活動(dòng)受限，電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)或磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)發(fā)現(xiàn)眼外肌增大；(4)視神經(jīng)功能障礙,如視力下降、瞳孔反射、色覺、視野異常，無法用其他病變解釋。若無眼瞼退縮者,須具備甲狀腺功能異常,還應(yīng)有以下體征之一,如眼球突出、眼外肌受累或視神經(jīng)功能障礙,并排除引起類似體征的其他眼??；(5)至少口服過兩周的GC。

根據(jù)研究對(duì)象對(duì)GC的反應(yīng)，將其分為敏感組和抵抗組，判定方法如下：(1)效果明顯：患者眼部自覺癥狀完全消失，眼突度回縮>2 mm，臨床活動(dòng)度評(píng)分(clinical activity score，CAS)下降>2分；(2)有改善：患者眼部自覺癥狀顯著改善，眼突度回縮1～2 mm，CAS評(píng)分下降1～2分；無效：患者眼部自覺癥狀無明顯變化，甚至加重，CAS評(píng)分升高。效果明顯和有改善判定為對(duì)GC敏感，無效判定為對(duì)GC抵抗。TAO患者的CAS評(píng)分中評(píng)估癥狀包括：(1)自發(fā)性球后疼痛；(2)眼球運(yùn)動(dòng)時(shí)疼痛；(3)眼瞼發(fā)紅、充血；(4)結(jié)膜彌漫性充血、發(fā)紅；(5)眼瞼水腫；(6)球結(jié)膜水腫；(7)淚阜水腫。出現(xiàn)每項(xiàng)癥狀便記1分。

1.1.2 IOIP患者的納入和分組標(biāo)準(zhǔn)

IOIP患者納入標(biāo)準(zhǔn)為：(基于臨床表現(xiàn)、超聲、CT/MRI)考慮為眼眶炎性假瘤的患者,已經(jīng)除外眼眶其他占位性病變,例如眼眶淋巴瘤、良性淋巴上皮病變、眼眶感染性疾病及肉樣瘤病等以及全身檢查除外其他全身相關(guān)性眼病；接受過至少兩周口服GC的治療。

IOIP患者對(duì)GC反應(yīng)性的判定方法如下：(1)效果明顯：臨床癥狀及體征消失且影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病變明顯消散，停藥半年沒有復(fù)發(fā)；(2)有改善:臨床癥狀及體征基本消失或者影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病變大部分消散;(3)無明顯改善:臨床癥狀及體征改善不顯著或反復(fù)發(fā)作且影像學(xué)檢查病變消散不明顯[10]。效果明顯和有改善判定為對(duì)GC敏感，無效判定為對(duì)GC抵抗。

1.2 試劑與儀器

紅細(xì)胞裂解液(自制)、TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)DP424]、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV Reverse Transcriptase，試劑號(hào) 28025-013，Invitrogen公司，美國)、 AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(諾唯贊科技有限公司，貨號(hào)Q511-02)、ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(quantitative real-time PCR, q-PCR)(Thermo Fisher 公司,美國)、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Thermo Scientifific SorvallTMLegendTMMicro 21 微量離心機(jī)，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)紅細(xì)胞裂解液配制：稱量41.16 g NH4Cl，0.5 g KHCO3, 0.02 g EDTA·2Na，溶于100 mL ddH2O，調(diào)pH至7.2，加ddH2O定容至500 mL。4 ℃保存，使用時(shí)先恢復(fù)至室溫。

2)地塞米松體外刺激:收集患者EDTA-K2新鮮外周抗凝血1 mL，分為對(duì)照組和處理組各0.5 mL。處理組加入終濃度為100 nmol/L 地塞米松，對(duì)照組加入等體積的二甲基亞砜，搖床上充分混勻30 min后，室溫靜置7 h。

3)外周血白細(xì)胞mRNA提取:①裂解紅細(xì)胞：每支離心管中加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液，用槍吹打混勻，冰上靜置10 min，然后300 g，4 ℃，離心5 min，棄上清。重復(fù)上述步驟。② 在離心管中加入1 mL TRNzol裂解液，用加樣槍反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，冰上孵育5 min。③ 加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩，冰上孵育5 min，14 865g,4 ℃離心15 min后，混合物分為3層。④ 將含有RNA的上層清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻后，冰上孵育20 min 后, 14 865g， 4 ℃離心15 min,棄上清。⑤加入1 mL 75% (體積分?jǐn)?shù))乙醇(DEPC處理過的離子水配制)，將沉淀從管底彈起，洗滌沉淀。5 806 g，4 ℃離心5 min，棄上清。⑥ 待乙醇揮發(fā)完，加入13 μL DEPC水溶解RNA，反復(fù)吹打混勻。檢測RNA溶液的濃度、純度和RNA的完整性。

4)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照賽默飛世爾科技公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。

5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)：在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Colalition Building Institute,NCBI)網(wǎng)站上查找人IL-6、TNF-α、GR-α及β標(biāo)準(zhǔn)序列，設(shè)計(jì)相關(guān)引物(見表1)。其中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因。

表1 IL-6、TNF-α、GR-α、GR-β及GAPDH引物核酸序列

按照諾唯贊科技有限公司試劑盒說明書配制體系，在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測。預(yù)變性條件為95 ℃ 5min；循環(huán)反應(yīng)的條件為95 ℃ 10 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。熔解曲線采集程序?yàn)锳BI 7500默認(rèn)設(shè)置。每份樣本測試3個(gè)PCR復(fù)孔。以空白樣本作為陰性對(duì)照。使用相對(duì)表達(dá)量方法來統(tǒng)計(jì)GR-α、GR-β、IL-6及TNF-α的表達(dá)水平，即將GR-α、GR-β、IL-6及TNF-α的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH水平，使用如下計(jì)算公式得到GR-α、GR-β、IL-6及TNF-α表達(dá)的相對(duì)定量：

改變的倍數(shù)(Fold Change)=2-ΔΔCT

其中ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)處理組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)未處理組

當(dāng)相對(duì)表達(dá)量>1，說明該基因的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài)；當(dāng)相對(duì)表達(dá)量<1，說明該基因的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本信息

62例TAO患者中男性27例，平均年齡(51.44±10.46)歲，女性35例，平均年齡(42.43±12.30)歲；36例IOIP患者中男性12例，平均年齡(46.73±12.78)歲，女性24例，平均年齡(46.66±9.45)歲。

2.2 q-PCR結(jié)果

擴(kuò)增曲線為典型的S型曲線，熔解曲線顯示每種引物的峰單一且特異，說明本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信。所有數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布。

TAO敏感組和抵抗組相比，GR-α、GR-β、IL-6和TNF-α濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；敏感組GR-α/β濃度高于抵抗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

IOIP患者敏感組與抵抗組相比，GR-α、IL-6及TNF-α濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；敏感組GR-β濃度低于抵抗組， GR-α/β濃度高于抵抗組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 IOIP患者IL-6、TNF-α、GR-α、GR-β檢測結(jié)果

2.3 GR-α/β與TAO、IOIP患者對(duì)GC敏感性的ROC曲線分析

TAO GR-α/β的曲線下面積(area under the ROC curve, AUC)為0.70(95%CI: 0.54～0.87)，臨界值為1.255，此時(shí)靈敏度和特異度分別為85%和53%; IOIP GR-α/β的AUC為0.77(95%CI: 0.58～0.95)，臨界值為1.005，此時(shí)靈敏度和特異度分別為90%和72%(圖1)。表明GR-α/β與TAO、IOIP患者對(duì)GC的敏感性有區(qū)分能力，二者之間存在一定聯(lián)系。

圖1 TAO及IOIP患者GR-α/β的ROC曲線Fig.1 The receiver operating characteristic (ROC) curve of GR-α/β in the TAO and IOIP patientsTAO: thyroid-associated ophthalmopathy; IOIP: idiopathic orbital inflammatory pseudotumor; GR: glucocorticoid receptor； ROC： receiver operating characteristic.

3 討論

TAO和IOIP發(fā)病率高，患者常出現(xiàn)眼瞼腫脹、眼壓高、畏光、視力下降等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。TAO女性發(fā)病率高于男性，目前病因不明，多認(rèn)為是眼眶成纖維細(xì)胞異常增殖和活化，炎性細(xì)胞分泌炎性因子增加以及糖胺聚糖在眼外肌的沉積共同導(dǎo)致了眼眶脂肪增生、眼外肌的水腫和纖維化[11]。此外，TAO患者發(fā)病的最小年齡為12歲。這提示雖然TAO一般多發(fā)于成年人，但是目前發(fā)病年齡逐漸年輕化。青少年及女性患者激素變化復(fù)雜，所以使用GC時(shí)應(yīng)更加慎重。臨床上需要一個(gè)簡單可靠的指標(biāo)來預(yù)測GC敏感性，為臨床下一步?jīng)Q策提供方向和依據(jù)。IOIP發(fā)病沒有性別和種族傾向性，男女患病率基本相等。在任何年齡均可發(fā)病，平均發(fā)病年齡為40～50歲。這個(gè)階段也是許多自身免疫性疾病的高發(fā)期。兩組患者對(duì)GC敏感和抵抗的比例為2～3∶1，這個(gè)數(shù)據(jù)也與之前的文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道吻合。

GC為親脂性的甾體類激素，通過被動(dòng)擴(kuò)散透過細(xì)胞膜，進(jìn)而與胞質(zhì)內(nèi)的GR結(jié)合。GR是一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子。GC與GR結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物發(fā)揮作用，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，GR與GCR密切相關(guān)。GR的親和力、數(shù)量、亞型的種類和比例、基因多態(tài)性及基因突變等都會(huì)影響患者對(duì)GC的反應(yīng)性。人體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均表達(dá)GR，因此GR基因相對(duì)保守，突變率低。檢測GR的數(shù)量、種類則是預(yù)測患者對(duì)GC敏感性的一個(gè)方便快捷的方法。GR主要有GR-α、β、γ及P等亞型，人體內(nèi)含量較多的是GR-α及β亞型，GR-α亞型有配體結(jié)合區(qū)，能夠與GC結(jié)合，而GR-β亞型缺乏配體結(jié)合區(qū)，因此無法與GC結(jié)合。許多文獻(xiàn)[14-15]顯示，GR-β能拮抗GR-α亞型，β亞型有負(fù)調(diào)節(jié)的作用。正常狀態(tài)下，GR-α與GR-β同時(shí)存在，當(dāng)其比例發(fā)生改變時(shí)，患者對(duì)GC的反應(yīng)性也會(huì)不同[16-17]。據(jù)報(bào)道[18-20]，GR-β濃度的升高與多種炎性疾病包括哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和急性淋巴細(xì)胞白血病的GCR有關(guān)。2010年，Lewis-Tuffin等[21]指出，采用GR-α/β來預(yù)測激素的療效其意義明顯優(yōu)于單獨(dú)的GR-α或GR-β，有助于全面和準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)激素的敏感性。這個(gè)指標(biāo)的研究[22-23]多集中于原發(fā)性腎病綜合征、突發(fā)性耳聾、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，在TAO患者和IOIP患者中鮮有研究。羅清禮等[24]的研究比較了TAO患者和健康對(duì)照組的GR-α/β，但是并未比較TAO患者中對(duì)GC敏感和抵抗組GR-α/β的差異。本研究的GCR患者GR-α/β明顯降低，且敏感組和抵抗組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明GR-α/β能很好地反映患者對(duì)GC的敏感性。單獨(dú)的GR-α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GR-α的表達(dá)水平及不同患者GR-α的表達(dá)差異與病程的長短、炎癥的活躍程度等有關(guān)。由于外周血取樣方便，檢測外周血白細(xì)胞的GR將是十分便捷、可靠的方法，對(duì)臨床診斷十分有意義。

人體內(nèi)眾多的炎性細(xì)胞因子由于其多效性、協(xié)同性及拮抗性等特點(diǎn)，形成一個(gè)十分復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與人體多種生理功能，在不同疾病的不同時(shí)期發(fā)揮特殊的作用，也影響著疾病的發(fā)展方向[25]。IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答中起重要作用。IL-6在活動(dòng)性TAO患者眼眶組織中過表達(dá)，可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化并激活Th1細(xì)胞，隨后釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致眼眶內(nèi)糖胺聚糖和脂肪的生成增加。TNF-α也與TAO的發(fā)病密切相關(guān)，其可激活多種炎癥細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及抗腫瘤作用，是TAO發(fā)病的主要前炎性因子。因此檢測其眼眶組織或者體液，例如血液、淚液等中TNF-α的濃度對(duì)于監(jiān)測患者疾病的發(fā)生發(fā)展程度具有十分重要的意義[26]。GC通過抑制促炎因子的合成及促進(jìn)抗炎因子合成發(fā)揮抗炎作用。IL-6及TNF-α是典型的促炎因子，因此GC會(huì)抑制IL-6及TNF-α的合成。TAO患者的IL-6及TNF-α雖然在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是敏感組與抵抗組均顯示下調(diào)狀態(tài)，這與GC發(fā)揮的功能表現(xiàn)一致。IOIP患者炎性因子均呈上調(diào)的狀態(tài)。這可能與IOIP的病情發(fā)展特點(diǎn)有關(guān)，該病極容易復(fù)發(fā)[1]，納入的患者也大多處在疾病活動(dòng)期，因此炎性因子呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。本研究為橫斷面研究，留取樣本時(shí)，部分患者已經(jīng)處于疾病的靜止期，此時(shí)的炎癥反應(yīng)已經(jīng)處于低水平，這也是實(shí)驗(yàn)的一個(gè)混雜因素。在以后的研究里，可以劃定基線，將疾病分期、炎癥活躍水平及用藥的療效綜合考慮，監(jiān)測各個(gè)時(shí)期的炎性因子表達(dá)。

TAO患者及IOIP患者GR-α/β的AUC分別為0.70(95%CI： 0.54～0.87)和0.77(95%CI： 0.58～0.95)。兩組指標(biāo)的AUC均在0.6～0.8之間，屬于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性較高的指標(biāo)。在兼顧靈敏度和特異度情況下，TAO患者臨界值取1.255，即GR-α/β<1.255時(shí)，可認(rèn)為患者對(duì)GC不敏感，此時(shí)靈敏度和特異度分別為85%和53%；IOIP患者臨界值取1.005即GR-α/β<1.005時(shí)，可認(rèn)為患者對(duì)GC不敏感，此時(shí)靈敏度和特異度分別為90%和72%。

本研究通過對(duì)外周血加藥刺激，體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M患者機(jī)體對(duì)GC反應(yīng)情況，檢測GR的mRNA，反映機(jī)體GR和炎性因子的表達(dá)潛力，能從轉(zhuǎn)錄水平預(yù)測患者對(duì)GC的敏感性。后續(xù)還可進(jìn)行GR蛋白水平的驗(yàn)證。研究還需再擴(kuò)大樣本量，統(tǒng)計(jì)患者治療前后指標(biāo)的差異，尤其是炎性因子，縱向比較，可能才會(huì)更好的說明問題。目前,對(duì)GC的反應(yīng)有效性的評(píng)價(jià)大多仍是基于臨床醫(yī)生的主觀判斷及患者的主觀感受。因此，規(guī)范疾病療效性的評(píng)價(jià)，完善疾病的診治方案是更好地應(yīng)用這些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的基礎(chǔ)和前提。