SAT法檢測人巨細胞病毒pp67 mRNA在人類免疫缺陷病毒合并人巨細胞病毒感染患者臨床診療中的價值探討

孟 歡 王 爽 何超男 韓 瑩 潘美晨 殷商啟 鄭 梅 金方方 王雅杰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科，北京 100015)

獲得性免疫缺陷綜合征是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的嚴重威脅人類健康的疾病，當(dāng)疾病進展至晚期常因嚴重免疫缺陷而合并多種機會性感染[1]。人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒β亞科，是皰疹病毒中最大的病毒，人體感染后大多呈現(xiàn)潛伏/無癥狀感染[2-3]，免疫力低下人群如獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者感染后易進展為HCMV終末器官疾病，在尸檢中大約90%的AIDS患者存在播散性HCMV感染[4]。由于AIDS患者的免疫功能低下，感染HCMV后，早期無明顯臨床癥狀，不易診斷。因此，對AIDS患者是否感染HCMV的早期篩查尤為重要。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)可利用反轉(zhuǎn)錄酶以及T7 RNA聚合酶對靶標RNA進行高效擴增，其優(yōu)勢在于靶標是RNA，在感染初期拷貝數(shù)大于DNA，靈敏度更高；RNA在病原體死亡后降解快，可以區(qū)分活動性感染和非活動性感染，可以用于評估療效；擴增產(chǎn)物是RNA，易降解，不易造成實驗室污染[5]。HCMV基質(zhì)表層蛋白pp67(phosphoprotein67, pp67) mRNA是晚期mRNA編碼的HCMV基質(zhì)表層蛋白核酸形式，該mRNA是真正晚期mRNA，可反映活動性HCMV感染[6]，可作為準確判斷活動性HCMV感染的指標，對于降低HCMV病的發(fā)生率和病死率都有重要意義。故本研究擬采用SAT技術(shù)檢測HCMV pp67 mRNA，并評估該方法及該指標在臨床應(yīng)用中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年7月至2020年2月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院接受巨細胞病毒DNA定量檢測的302例患者，其中HIV陽性HCMV活動性感染患者69例、HIV陽性HCMV非活動性/潛伏感染154例、HIV陰性HCMV 非活動性/潛伏感染 79例。樣本類型包括血清、腦脊液、肺泡灌洗液。

入組標準[7-8]：

(1)HIV陽性患者：HIV抗體初篩及確證試驗均為陽性的患者。

(2)HIV陰性患者：HIV抗體初篩試驗陰性且流行病學(xué)調(diào)查排除HIV陽性暴露可能性。

(3)HCMV活動性感染：①抗HCMV特異性抗體IgG(immunoglobulin G, IgG)陽性；②抗HCMV特異性抗體IgM(immunoglobulin M, IgM)陽性且有相應(yīng)器官/部位巨細胞病毒感染的特征性臨床表現(xiàn)；③HCMV DNA陽性且有相應(yīng)器官/部位巨細胞病毒感染的特征性臨床表現(xiàn)。同時滿足①、②或①、③兩點或三點都滿足即可診斷為HCMV活動性感染。

(4)HCMV非活動性/潛伏感染：①抗HCMV特異性抗體IgG陽性；②無相應(yīng)器官/部位巨細胞病毒感染的特征性臨床表現(xiàn)。同時滿足①、②兩點可診斷為HCMV非活動性/潛伏感染。

1.2 SAT 法建立

1.2.1 試劑

標準品、樣品稀釋液、酶反應(yīng)液(M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶)、樣品提取液均由上海仁度公司提供。

1.2.2 SAT法反應(yīng)條件

PCR循環(huán)設(shè)置：42 ℃ 1 min，40個循環(huán)。儀器為上海仁度全自動核酸分析系統(tǒng)(Auto SAT)。

1.2.3 結(jié)果判讀

dt(detection time)為樣本曲線與閾值交點的橫坐標讀數(shù)。陽性(0

1.2.4 SAT法檢測HCMV pp67 mRNA性能評估

分析性能評估：檢出限、重復(fù)性、特異性的評估均參照2019年《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[9]、《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[10]和2019年《臨床化學(xué)定量檢驗程序性能驗證指南》[11]中要求設(shè)計。

(1)檢測下限評估：將濃度為1010copies/mL的HCMV 標準液稀釋成500、400、300 copies/mL，每個濃度重復(fù)檢測25次，計算陽性檢出率。陽性檢出率=(實際檢出次數(shù)/重復(fù)檢測總次數(shù))×100%，0

(2)重復(fù)性評估：將濃度為1010copies/mL的HCMV 標準液稀釋至4.0×103、4.0×104、4.0×105copies/mL 3個濃度后，每個濃度重復(fù)測量20次，計算變異系數(shù)(coefficient of variance,CV)值。判定標準：滿足試劑廠家性能標準，CV<10%。

(3)特異性評估:收集甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)陽性血漿樣本、HIV-1陽性血漿樣本、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)陽性血清樣本、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)陽性血清樣本、人類皰疹病毒3型(human herpes virus-3, HHV-3)陽性全血樣本、單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus-2, HSV-2)陽性陰道拭子樣本、腸道病毒陽性肛拭子樣本；對樣本進行病毒定量，定量后稀釋至如下濃度：HAV1 000 IU/mL、HBV 100 000 IU/mL、HCV 100 000 IU/mL、HIV-1 1 000 IU/mL、HHV-3 100 000 copies/mL、HSV-2 100 000 copies/mL和腸道病毒 100 000 copies/mL，將稀釋后的樣本加入到HCMV陰性樣本中，進行HCMV pp67 mRNA檢測，每個樣本檢測2次。檢測結(jié)果均為陰性則判定為特異性符合臨床要求。

1.3 實驗室檢測指標及方法

(1)HCMV DNA定量檢測：采用PCR-熒光定量方法檢測試劑盒(中山大學(xué)達安基因)檢測血清、肺泡灌洗液、腦脊液樣本中的HCMV DNA，儀器為Applied Biosystems 7500型定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；檢測結(jié)果≥500 copies/mL為陽性，<500 copies/mL為未檢測到。

(2)抗HCMV IgG、 IgM特異性抗體檢測：采用電化學(xué)發(fā)光法檢測患者血清中抗HCMV IgG(人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒購自德國Roche公司)和IgM(人巨細胞病毒IgM抗體檢測試劑盒購自德國Roche公司)特異性抗體，Cobas E602 電化學(xué)發(fā)光分析儀購自德國羅氏公司。

(3)HIV-1核糖核酸 (RNA)定量檢測：采用聚合酶鏈反應(yīng)熒光法檢測HIV (Ⅰ型) 核酸[HIV(Ⅰ型) 核酸定量檢測試劑盒購自瑞士Roche公司], 儀器為瑞士羅氏cobasAmpliPrep/cobas TaqMan病毒載量檢測系統(tǒng)。

(4)T淋巴細胞亞群絕對計數(shù)：采用美國BD公司FACSCantoTMⅡ流式細胞儀及其配套試劑檢測。

(5)總蛋白、白蛋白檢測：采用日本HITACHI 7600全自動生化分析儀及北京利德曼生化股份有限公司試劑進行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床特征

在302例患者中，HIV陽性HCMV活動性感染組、HIV陽性HCMV非活動性/潛伏感染組以及HIV陰性HCMV 非活動性/潛伏感染組的平均年齡和性別分布，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 研究對象的臨床特征

2.2 SAT法性能評估結(jié)果

2.2.1 檢測下限評估

表2結(jié)果顯示，500、400 copies/mL的HCMV 標準品的檢出率均為100%，而300 copies/mL的HCMV標準品的檢出率為80%，故檢出下限為400 copies/mL。

表2 檢出下限性能驗證結(jié)果

續(xù)表2

2.2.2 重復(fù)性評估

3個濃度的重復(fù)性評估CV值均小于10%，詳見表3。

表3 重復(fù)性驗證結(jié)果

2.2.3 特異性評估

表4檢測結(jié)果顯示均為陰性，證明該試劑的特異性符合標準。

表4 特異性驗證結(jié)果

2.3 不同指標檢測HCMV結(jié)果及檢驗效能評價

2.3.1 不同指標檢測HCMV結(jié)果

將302例患者的血清樣本分別用于檢測抗HCMV特異性IgG抗體、抗HCMV特異性IgM抗體；血清、肺泡灌洗液、腦脊液樣本用于HCMV DNA和HCMV pp67 mRNA的檢測，其中同一患者在同一時間段內(nèi)(樣本送檢間隔時間小于7 d)的不同類型樣本，只要當(dāng)中某一種樣本檢測出陽性結(jié)果，則視該患者為HCMV DNA陽性病例或HCMV pp67 mRNA陽性病例。3組患者中，抗HCMV特異性IgG抗體陽性率為100%，HIV+HCMV活動性感染組、HIV+ HCMV非活動性/潛伏感染組和HIV- HCMV非活動性/潛伏感染組的抗HCMV特異性IgM抗體陽性率分別為13.04%、0.08%和0.07%；HCMV DNA陽性率分別為86.96%、30.52%和0%；HCMV pp67 mRNA陽性率分別為60.87%、18.83%和0%。結(jié)果詳見表5。

表5 不同指標檢測HCMV結(jié)果Tab.5 Results of different indicators used in HCMV detection

2.3.2 3種檢測指標的檢驗效能比較

根據(jù)入組標準，將3組人群合并為兩大組分別為HCMV活動性感染組、HCMV非活動性/潛伏感染組，計算HCMV DNA、HCMV pp67 mRNA、抗HCMV 特異性IgM抗體3種指標的特異度、靈敏度、陽性預(yù)測值(positive predictive value, PPV)、陰性預(yù)測值(negative predictive value, NPV)，正確率以及約登指數(shù)(Youden index, YI)。3種檢測指標中，抗HCMV 特異性IgM抗體特異度最高為91.85%，HCMV DNA靈敏度最高為86.96%，HCMV DNA和HCMV pp67 mRNA的PPV接近，分別為0.56和0.59，3種指標的NPV由高到低分別為HCMV DNA 0.95, HCMV pp67 mRNA 0.88以及抗HCMV IgM 0.78；HCMV DNA和HCMV pp67 mRNA的正確率相同都為81.46%，抗HCMV IgM的正確率稍低為73.84%；3種檢測指標中HCMV DNA的約登指數(shù)最高為0.67，其次為HCMV pp67 mRNA 0.48, 而抗HCMV IgM的約登指數(shù)僅為0.04。檢驗效能HCMV DNA大于HCMV pp67 mRNA大于抗HCMV IgM。結(jié)果詳見表6。

表6 不同指標診斷HCMV活動性感染的檢驗效能

2.3.3 SAT法與臨床診斷陽性檢出率比較

將HCMV pp67 mRNA的陽性檢出率與臨床診斷結(jié)果作比較，結(jié)果顯示SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的陽性檢出率與臨床診斷的陽性檢出率相比，P=0.894, 兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果表明兩者的陽性檢出率相近。詳見表7。

表7 STA法HCMV pp67 mRNA陽性檢出率與臨床診斷結(jié)果比較

2.4 HCMV pp67 mRNA結(jié)果與其他臨床指標的關(guān)聯(lián)

從2.3的結(jié)果顯示出SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的檢驗效能適中，陽性檢出率與臨床診斷差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)HCMV pp67 mRNA結(jié)果陽性與否，HIV陽性與否，將患者重新分為HIV+ HCMV pp67 mRNA+組、HIV+ HCMV pp67 mRNA-組以及HIV- HCMV pp67 mRNA-組，分別比較3組患者的T淋巴細胞亞群和生物化學(xué)指標，以及HIV+的兩組患者的HIV載量。

2.4.1 HIV+患者HCMV pp67 mRNA陽性組與陰性組HIV載量(log值)比較

根據(jù)表8、圖1結(jié)果可知，HCMV pp67 mRNA陽性組患者的HIV載量要高于HCMV pp67 mRNA陰性組(P=0.003)，血中HIV載量高的患者HCMV活動性感染的概率更大。

圖1 HIV+患者中HCMV pp67 mRNA陽性組與HCMV pp67 mRNA陰性組HIV載量比較Fig.1 Comparison of HIV load between HCMV pp67 mRNA positive group and HCMV pp67 mRNA negative group in HIV+patients** P<0.01； HIV: human immunodeficiency virus; HCMV: human cytomegalovirus； pp67： phosphoprotein67.

表8 HIV+患者中HCMV pp67 mRNA陽性組與HCMV pp67 mRNA陰性組HIV載量比較

2.4.2 3組患者T淋巴細胞亞群計數(shù)的差異比較

經(jīng)過比較，三組患者的CD45+淋巴細胞(CD45+lymphocyte, CD45+)計數(shù)、CD3+T淋巴細胞(CD3+T lymphocyte, CD3+)計數(shù)、CD3+CD8+T淋巴細胞(CD3+CD8+T lymphocyte, CD3+CD8+)計數(shù)、CD3+CD4+T淋巴細胞與CD45+淋巴細胞的比值(CD3+CD4+lymphocyte/CD45+lymphocyte，CD3+CD4+/CD45+)、CD3+CD4+T淋巴細胞(CD3+CD4+T lymphocyte, CD3+CD4+)計數(shù)、CD3+CD4+T淋巴細胞與CD3+CD8+T淋巴細胞的比(CD3+CD4+/CD3+CD8+),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果詳見表9。組間兩兩比較可知，表中各指標除CD3+CD8+ T淋巴細胞計數(shù)外，HIV+組均低于HIV-組；表中各指標組間兩兩比較結(jié)果中，HIV+ HCMV pp67 mRNA+組均要低于HIV+ HCMV pp67mRNA-組，結(jié)果提示免疫能力越差，HCMV活動性感染的可能性越高。組間比較結(jié)果詳見圖2。

圖2 3組患者T淋巴細胞亞群計數(shù)差異比較Fig.2 The difference of T lymphocyte subsets count in the three groupsA：CD45+ lymphocyte counts; B：CD3+ T lymphocyte counts; C： CD3+CD4+T lymphocyte counts; D：CD3+CD8+ T lymphocyte counts; E：CD3+CD4+ T lympocyte to CD3+CD8+ T lymphocyte ratio;F： CD3+CD4+ T lymphocyte to CD45+ lymphocyte ratio; *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001; HIV: human immunodeficiency virus; pp67： phosphoprotein67.

表9 不同組之間T淋巴細胞亞群計數(shù)的差異

2.4.3 3組患者血漿白蛋白、白球比的差異比較

3組患者中，HIV+ HCMV pp67 mRNA+組患者血漿白蛋白數(shù)量以及白球比均要低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表10和圖3。

表10 不同組之間ALB和A/G的差異

圖3 3組患者血漿白蛋白、白球比的差異比較Fig.3 Comparison of plasma albumin, albumin globule ratio in the three groupA: albumin quantity; B: albumin to globulin ratio;*P<0.05， ** P<0.01，***P<0.001； ALB： albumin； A/G： albumin globule ratio; HIV: human immunodeficiency virus; pp67： phosphoprotein67.

3 討論

HIV患者共感染HCMV后，因其自身免疫低下，體內(nèi)潛伏感染的HCMV易發(fā)展為活動性感染，導(dǎo)致HCMV終末器官疾病，主要表現(xiàn)為巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎，還可累及肺、腸道、腎上腺、腦等器官，HCMV也可通過血液造成播散性感染[12]。因此，良好的指標和方法輔助診斷HCMV活動性感染對于HIV患者的預(yù)后和免疫重建有重要意義。

SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的各項性能驗證結(jié)果均達到臨床檢測要求，該方法可以用于臨床樣本的檢測；在檢驗效能比較中，HCMV DNA的靈敏度、正確診斷指數(shù)(即約登指數(shù))在3個指標中最高，但HCMV DNA檢測存在局限性，HCMV DNA陽性不能用于辨別患者是否處于活動性感染[13]；抗HCMV特異性IgM抗體的特異度雖達到91.85%，但這可能是由于HIV患者免疫低下，患者無法產(chǎn)生足量的抗體，從而導(dǎo)致抗HCMV特異性IgM抗體結(jié)果假陰性[14]。SAT法檢測HCMV pp67 mRNA的檢驗效能適中，且與臨床診斷結(jié)果比較，能較好地分辨患者是否處于現(xiàn)癥感染，有良好的輔助診斷價值。

HCMV pp67 mRNA陽性的HIV患者其自身的免疫功能較差，HIV載量較高；和其他兩組比，HCMV pp67 mRNA陽性組血漿白蛋白更少，有研究[15-16]顯示白蛋白可以與抗反轉(zhuǎn)錄病毒的藥物非特異性結(jié)合，對于維持血藥濃度以及藥物作用時間有一定意義，低白蛋白血癥可能與抗病毒治療失敗有關(guān)。從以上兩點可得，免疫重建失敗，抗病毒治療失敗的HIV患者更易使HCMV潛伏感染激活或重新感染HCMV；此外，也有研究[17]表明，HCMV感染人體后會引起免疫抑制，這也可能進一步導(dǎo)致HIV患者免疫重建困難，從而更易誘發(fā)機會性感染。

綜上，SAT法檢測HCMV pp67 mRNA可以用于臨床輔助診斷HCMV活動性感染，也可輔助評估HIV患者免疫重建、抗病毒治療的效果；HCMV pp67 mRNA陽性患者建議監(jiān)測白蛋白濃度以及免疫重建、抗病毒治療的療效。