腹腔感染耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的毒力特征

馬立艷 孫 偉 夏 帥 蘇建榮*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院檢驗科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學研究生院，北京 100069)

既往研究[7]顯示，與肺炎克雷伯菌致病相關的毒力因子包括莢膜多糖、菌毛和鐵載體等。參與調控莢膜多糖合成的毒力基因黏液表型調節(jié)基因A(regulator of mucoid phenotype A，rmpA)位于肺炎克雷伯菌的毒力質粒(large virulence plasmid ofKlebsiellapneumoniae，pLVPK)上，與肺炎克雷伯菌黏附宿主細胞和生長增殖相關。鐵載體是一種低相對分子質量的鐵螯合劑，由細菌在乏鐵條件下分泌，促進細菌的生長繁殖、加重感染，是肺炎克雷伯菌毒力增強的重要原因之一。其中，氣桿菌素和受體由iucABCD-iucA基因簇編碼，也位于pLVPK毒力質粒上，是HvKP產(chǎn)生的最重要的鐵載體[8]。

因此，本研究選取侵襲性腹腔感染部位分離的CRKP菌株為研究對象，通過基因分型、篩查耐藥基因和致病基因的攜帶情況、檢測生物膜形成能力和鐵載體生成能力，闡述CRKP的毒力特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2016至2019年首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院侵襲性腹腔感染部位分離的CRKP菌株38株，剔除同一患者相同部位重復分離的菌株。CRKP定義為肺炎克雷伯菌對美羅培南、亞胺培南或厄他培南中介或耐藥，或產(chǎn)生碳青霉烯酶[9]。所有菌株保存于-80 ℃無菌脫脂牛奶中。

1.2 試劑與儀器

菌株鑒定使用法國生物梅里埃公司的VITEK MS飛行時間質譜儀及其配套試劑；藥敏試驗使用法國生物梅里埃公司的VITEK 2 Compact及其配套藥敏卡片AST334，鄭州安圖生物工程股份有限公司的E-test條，以及英國OXIOD公司的藥敏紙片；腦心浸液、LB等培養(yǎng)基購自英國OXIOD公司；結晶紫、鉻天青S(chrome azurol sulfonate,CAS)、無水哌嗪、三氯化鐵、三甲基十六烷基溴化胺(hexadecyl trimethyl ammonium, HDTMA)等試劑購自美國Sigma公司；細菌基因組提取試劑盒和PCR試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；脈沖場凝膠電泳儀和分光光度計為美國Bio-Rad公司的產(chǎn)品；PCR儀器為美國應用生物系統(tǒng)公司的ABI 7500；測序儀為美國應用生物系統(tǒng)公司的3730XL。藥敏質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，按照臨床和實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)制定的抗微生物藥物敏感試驗執(zhí)行標準M100-S30文件中的折點進行判讀。

1.3 生物膜形成實驗

參照文獻[10]，挑取分純培養(yǎng)的CRKP菌落1～2個，制備2.0～3.0×108CFU/mL的菌懸液，用腦心浸液稀釋100倍，取200 μL加入96孔板，每孔CRKP的終濃度為5×105CFU/mL，腦心浸液作為陰性對照，肺炎克雷伯菌ATCC700603作為陽性對照，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。200 μL PBS洗板3次，加入甲醇200 μL固定生物膜15 min，室溫干燥10 min。0.5%(質量分數(shù))的結晶紫100 μL染色5 min，300 μL無菌水洗板。待室溫干燥后，加入33%(體積分數(shù))的乙酸，搖床震蕩10 min充分溶解生物膜。每株菌重復3次試驗，取均值計算595 nm處的吸光度A595。

1.4 鐵載體生成實驗

參照文獻[11]，將1.5 mL 1 mol/L FeCl3溶液加入到7.5 mL 2 mol/L CAS溶液中，混勻后加入到6 mL 10mol/L HDTMA溶液中，然后將30 mL水溶無水哌嗪(pH值5.6)加入到上述溶液中，定容至100 mL，制成CAS定量檢測液。將待測菌株在含有4 mol/L去鐵胺的LB培養(yǎng)基中孵育48 h，離心收集上清，用0.22 μm 濾膜過濾，濾后上清與CAS定量檢測液等體積混合。LB培養(yǎng)液作為參照同步操作，含4 mol/L去鐵胺的LB培養(yǎng)液作為鐵離子螯合的質控。每株菌重復3次試驗，取均值計算待測菌株在630 nm處的吸光度A630。

1.5 拉絲試驗

用無菌環(huán)挑取過夜孵育的CRKP菌落，拉絲長度>5 mm即為拉絲試驗陽性。

1.6 致病基因和耐藥基因檢測

參照文獻[5,12]，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)方法檢測致病基因rmpA2和iucA，碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP-4、blaVIM-1和blaOXA-48。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳，陽性產(chǎn)物測序并與美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

將僅檢出碳青霉烯酶基因blaKPC-2的菌株作為KPC組，同時檢出blaKPC-2和致病基因rmpA2和iucA的菌株作為KPC+rmpA2+iucA組，兩組之間進行生物膜形成能力和鐵載體生成能力的比較。

通過調查研究發(fā)現(xiàn)男性大學生的自我效能感顯著高于女性，因為無論在高校還是社會中，男性在體力、智力、耐力、心理素質等方面明顯優(yōu)于女性，在社會各行業(yè)中對男大學生的需求日益增多，間接提升了高校男性大學生的自信能力，進而影響自我效能感。參與過志愿和基層服務的高校大學生與未參與過志愿和基層服務的高校大學生在自我效能感方面具有顯著差異，說明在從事志愿和基層服務時，高校大學生所學的理論知識和技能得到實踐，在語言溝通、人際交往、統(tǒng)籌協(xié)調能力等方面得到了提升，使得這些從事過志愿和基層服務者的高校大學生通過服務他人的過程中自我滿足感和幸福感得到升華，進而影響其自我效能感。

1.7 多位點序列分型

根據(jù)肺炎克雷伯菌多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)數(shù)據(jù)庫(http://bigsdb. web.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html)提供的引物序列和反應條件擴增7對管家基因(gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi、rpoB)，將擴增產(chǎn)物測序結果與MLST數(shù)據(jù)庫比對，確定ST型別。根據(jù)是否為ST11型分為ST11組與非ST11組。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 實驗菌株及其耐藥特征

共收集38株CRKP，對至少一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，包括亞胺培南、厄他培南或美羅培南，MIC范圍為4～128 μg/mL。對替加環(huán)素和黏菌素的MIC50分別為1.0 μg/mL和0.25 μg/mL。在38株CRKP菌株中，碳青霉烯酶的檢出率為84.2%(32/38)。僅攜帶blaKPC-2的菌株檢出率最高，為76.3%(29/38)，其中ST11組的檢出率高于非ST11組，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。只攜帶blaNDM-1的菌株次之，為5.3%(2/38)，1株CRKP同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1，未檢測到blaOXA-48、blaVIM-1和blaIMP-4型碳青霉烯酶。ST11為主要克隆株，占比78.1%(25/38)，其次為ST37型，占比10.5%(4/38)，此外還檢出2株ST258和1株ST147，另有6株未知型別，詳見表1。

表1 CRKP菌株的耐藥特征Tab.1 Resistance characteristics of CRKP strains n(%)

2.2 致病基因的檢測情況

38株CRKP中，共23株檢測到rmpA2或iucA，其中21株同時攜帶rmpA2和iucA。ST11組同時攜帶rmpA2和iucA菌株的檢出率為60.0%，非ST11組同時攜帶rmpA2和iucA菌株的檢出率為46.2%，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在ST37型和ST258型的菌株中未檢測到rmpA2或iucA。在21株同時攜帶rmpA2和iucA的菌株中，14.3%(3/21)的菌株拉絲試驗陽性,詳見表2。

表2 CRKP菌株的致病基因檢測結果Tab.2 Distribution of virulence genes harbored by CRKP strains n(%)

2.3 不同組別生物膜形成能力比較

38株CRKP均可形成生物膜，A595位于0.1～0.8之間，形成生物膜的能力均較弱。與非ST11組相比，ST11型CRKP組形成生物膜的能力略高，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。KPC組與KPC+rmpA2+iucA組生物膜形成能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 不同組別間生物膜形成能力的比較Fig.1 Comparison of biofilm formation in different CRKP groupsCRKP: carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae.

2.4 不同組別鐵載體生成能力比較

38株CRKP均可生成鐵載體，鐵載體生成能力ST11組高于非ST11組，KPC+rmpA2+iucA組高于KPC組，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同組別間鐵載體生成能力的比較Fig.2 Comparison of siderophore production in different CRKP groupsCRKP: carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae.

3 討論

在我國，CRKP最常見的基因型別為ST11型，該克隆株傳播性強，是臨床重癥感染的主要病原菌，部分菌株僅保留了對黏菌素、替加環(huán)素的敏感性[13-14]。而攜帶rmpA、rmpA2和鐵載體基因的pLVPK質粒，是一種可移動的、大約170 000 bp的毒力元件，可與碳青霉烯酶耐藥基因整合。2017年，Gu等[5]對呼吸機相關肺炎中分離的CR-HvKP菌株進行了分子流行病學研究，證實ST11型CRKP獲得了pLVPK質粒后具有高毒力、高耐藥、高傳播的特點，成為臨床抗感染治療的重大威脅。此后，中國不同地區(qū)也相繼報告，河南省和山東省較高，CR-HvKP檢出率分別為25.4%和25.8%，提示CR-HvKP可能已經(jīng)在國內引起了播散[15]。

既往研究[2，16]顯示，與經(jīng)典型肺炎克雷伯菌相比，HvKP往往表現(xiàn)高黏性表型，因此通常將拉絲試驗陽性作為HvKP的診斷標準。但是，Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高黏性與毒力并無直接相關性，拉絲試驗陰性的菌株也可能引起嚴重的感染，引起糖尿病小鼠更高的病死率。近期兩項中國學者的研究[17-18]顯示，HvKP中僅28.9%或30.9%的菌株拉絲試驗陽性，與Zhang等[19]研究中10.9%CR-HvKP菌株拉絲試驗陽性相似，本研究中的陽性率為14.3%，因此，拉絲試驗作為鑒定HvKP的方法并不可靠。大蠟螟LD50和動物實驗對鑒定HvKP更為確切，但因其操作復雜，并不適合在臨床實驗室常規(guī)開展。本研究中，88.0%的ST11型菌株中僅檢測到blaKPC-2，60.0%的ST11型菌株同時攜帶rmpA2和iucA，rmpA2和iucA在攜帶blaKPC-2的ST11型菌株中檢出率明顯增高。Gu等[5]也證實，毒力基因iucABCD、rmpA2和iut是ST11型CR-HvKP特有，而經(jīng)典型ST11型CRKP則不具有。因此，目前將菌株的表型、基因型和毒力實驗相結合鑒定CR-HvKP是相對可靠的方法，但需要進一步研究篩選出高毒力菌株的特征性生物標志物。

生物膜的形成不僅造成抗菌藥物治療效果不佳，還容易引起感染復發(fā)，進一步加重CRKP菌株感染的治療難度。而一旦生物膜形成，可能會造成CRKP在醫(yī)院環(huán)境中定植、播散。本研究中，不同ST型別間、攜帶耐藥基因和致病基因的不同組別間生物膜形成能力差異無統(tǒng)計學意義。實驗所用CRKP菌株形成生物膜的能力均較弱，可能與獲得性耐藥導致毒力受損有關，如生物膜形成相關蛋白的低水平表達，具體的機制尚需進一步研究。與HvKP常常引起健康人社區(qū)獲得性感染不同，CRKP通常與侵入性操作、免疫功能受損等有關，造成毒力相對較低的耐藥株也可引起嚴重的侵襲性感染。此外，在體內抗菌藥物選擇壓力下，細菌往往比體外試驗更易形成生物膜。

鐵載體，尤其是氣桿菌素，幫助細菌從宿主體內環(huán)境獲得鐵離子，明顯提高肺炎克雷伯菌在腹水和血清中的生存率，是HvKP重要的致病機制，往往引起嚴重的臨床感染。既往對肝膿腫分離HvKP菌株的研究[8,19]證實，鐵載體是高毒力的特征性標志物，但是這些研究所用的菌株對臨床常用抗菌藥物均表現(xiàn)良好的敏感性。本研究選取侵襲性腹腔感染部位分離的CRKP菌株，結果顯示，同時攜帶blaKPC-2、rmpA2和iucA的菌株，鐵載體產(chǎn)生的能力明顯升高，提示rmpA2和iucA是CR-HvKP重要的毒力因子。僅攜帶blaKPC-2的菌株雖然產(chǎn)生鐵載體的能力較低，但是在乏鐵環(huán)境中仍然可以分泌鐵載體維持自身生長繁殖。

綜上所述，同時攜帶KPC-2型耐藥基因、rmpA2和iucA毒力基因的ST11型CRKP，使抗感染治療形勢更為嚴峻，需要采取嚴格的醫(yī)院感染防控措施和/或進行主動篩查，以防止其在醫(yī)療機構內播散流行。