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    北京市順義區(qū)零售生豬肉中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測與病原特征分析

    2021-11-03 08:34:54張彥春冀國強(qiáng)馬紅梅張茂俊
    中國人獸共患病學(xué)報(bào) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:耶爾森菌液毒力

    張彥春,楊 波,王 苗,冀國強(qiáng),馬紅梅,李 穎,張茂俊

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)可導(dǎo)致耶爾森菌病[1-2],廣泛分布于自然界,是少數(shù)幾種能在冷藏溫度下生長的腸道致病菌之一,該菌天然寄居在多種動(dòng)物體內(nèi),通過污染食物(牛奶、豬肉等)和水經(jīng)糞-口途徑感染或因接觸染疫動(dòng)物而感染[3-5]。Y.enterocolitica的毒力基因主要有5種,其中包括染色體源毒力基因ail、ystA、ystB和質(zhì)粒源毒力基因yadA、virF,與人腹瀉密切相關(guān)[6]。Y.enterocolitica嗜冷,因此歐洲高緯度國家耶爾森菌病流行強(qiáng)度較高[3-5]。北京雖處于溫帶地區(qū),但冬季時(shí)間長且氣溫低,極有可能具備Y.enterocolitica流行的先決條件。

    因體外培養(yǎng)Y.enterocolitica菌落小且菌落特征不典型,造成實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)Y.enterocolitica難度增加,通常需要經(jīng)驗(yàn)豐富技術(shù)人員的仔細(xì)甄別,容易造成菌落遺漏和錯(cuò)誤識別。本研究對70份零售生豬肉樣品進(jìn)行Y.enterocolitica檢測,為提高分離培養(yǎng)陽性率,本研究在傳統(tǒng)增菌分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上增加了對增菌液進(jìn)行Y.enterocolitica特異基因熒光PCR預(yù)篩查檢測,旨在準(zhǔn)確獲得本地區(qū)零售生豬肉中Y.enterocolitica分布及病原特征。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 樣品來源 采集來自北京順義區(qū)超市和小型市場零售攤位的生豬肉樣品,采樣時(shí)間2019年3月至2020年10月,共計(jì)70件。樣品采集后4 ℃暫存,2 h內(nèi)送入順義區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室檢測。

    1.1.2 主要儀器與試劑 耶爾森選擇培養(yǎng)基為美國OXOID公司產(chǎn)品;改良磷酸鹽緩沖液(PSB)、胰酪大豆瓊脂(TSA)、改良克氏雙糖鐵(KIA)為北京陸橋公司產(chǎn)品;脈沖場凝膠電泳試驗(yàn)使用的Tris-Hcl、EDTA、SDS、TBE、蛋白酶K為索萊寶公司產(chǎn)品;NotI、XbaI內(nèi)切酶為美國NEB公司產(chǎn)品;傳統(tǒng)PCR反應(yīng)液(Premix TaqTMVersion 2.0)為TaKaRa公司產(chǎn)品;小腸結(jié)腸炎耶爾森菌熒光PCR檢測試劑盒(foxA基因)為北京卓成惠生公司產(chǎn)品(A2160);小腸結(jié)腸炎耶爾森菌多重?zé)晒釶CR鑒定及毒力基因分型檢測試劑盒為青島中創(chuàng)匯科生物制品有限公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀(美國伯樂CFX96 Tough型),脈沖場凝膠電泳儀(美國伯樂CHEF Mapper)、細(xì)菌鑒定儀(法國梅里埃公司VITEK 2 compact)。

    1.2 方 法

    1.2.1Y.enterocolitica分離培養(yǎng) 將25 g生豬肉樣本加入225 mL改良磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行4 ℃冷增菌,時(shí)間為20 d。用10 μL 接種環(huán)取1環(huán)增菌液接種耶爾森選擇培養(yǎng)基26 ℃培養(yǎng)48 h,Y.enterocolitica可疑菌落中央深紅色且周圍具有無色透明圈。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)》(GB4789.8-2016)中分離培養(yǎng)步驟,挑取5個(gè)可疑單菌落接種改良克氏雙糖鐵瓊脂,然后挑取培養(yǎng)物進(jìn)行foxA基因熒光PCR檢測,foxA基因陽性菌落轉(zhuǎn)種TSA平板26 ℃純培養(yǎng)24 h,純培養(yǎng)菌落使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定。

    1.2.2 增菌液熒光PCR預(yù)篩查檢測 改良磷酸鹽緩沖液冷增菌20 d后吸取200 μL至EP管中,100 ℃金屬浴加熱10 min,8 000 r/min離心10 min,取上清作為模板進(jìn)行foxA基因熒光PCR預(yù)篩查檢測。若增菌液熒光PCR篩查foxA基因陽性而Y.enterocolitica培養(yǎng)陰性,則將增菌液重新接種耶爾森選擇培養(yǎng)基26 ℃培養(yǎng)48 h,挑取更多可疑單菌落進(jìn)行foxA基因熒光PCR檢測,直至挑取到foxA基因陽性單菌落,然后純化培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

    1.2.3 分離株毒力基因、分子分型和抗生素敏感性檢測 將生豬肉中分離的Y.enterocolitica陽性菌株和本地區(qū)2017-2019年腹瀉病例中分離的3個(gè)Y.enterocolitica菌株進(jìn)行毒力基因(ail、ystA、ystB、yadA、virF)普通PCR檢測[6]、毒力基因熒光PCR檢測(小腸結(jié)腸炎耶爾森菌多重?zé)晒釶CR鑒定及毒力基因分型檢測試劑盒)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型檢測[7]和抗生素敏感性試驗(yàn)(上海星佰革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板,D板)。PFGE指紋圖譜(NotI酶切)上傳國家致病菌識別網(wǎng)進(jìn)行比對分析。耐藥、中介、敏感的判定依據(jù)為CLSI M100-S28。抗生素包括青霉素類:氨芐西林(Ampicillin, AMP)、氨芐西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam, AMS);一代頭孢:頭孢唑林(Cefazoin, CFZ);二代頭孢:頭孢西丁(Cefoxitin, CFX);三代頭孢:頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime, CTX);碳青霉烯類:亞胺培南(Imipenem, IMP);大環(huán)內(nèi)酯類:阿奇霉素(Azithromycin, AZM);四環(huán)素類:四環(huán)素(Tetracycline,TET);喹諾酮/氟喹諾酮類:萘啶酸(Nudic Acid, NAL)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP);氯霉素類:氯霉素(Chloramphenicol, CHL);氨基糖苷類:慶大霉素(Gentamicin, GEN);磺胺類:復(fù)方磺胺(Trimeth-sulfame, SXT);測試抗生素共包括7大類14種(青霉素類、頭孢類和碳青霉烯類均歸為β內(nèi)酰胺類)。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用卡方檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。

    2 結(jié) 果

    2.1 菌株分離情況 70份樣品中,6份使用傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)法Y.enterocolitica分離培養(yǎng)陽性,陽性率8.57%(6/70);19份增菌液foxA基因熒光PCR預(yù)篩查檢測陽性(6份傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)法陽性樣本均包含在內(nèi)),陽性率27.14%(19/70);13份增菌液foxA基因預(yù)篩查檢測陽性,但Y.enterocolitica分離培養(yǎng)陰性樣品通過增加挑取可疑菌落數(shù)量(20~50個(gè)單菌落)的方式最終均成功分離到菌株。4個(gè)季節(jié)樣本檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.390,P值=0.222);超市和市場零售樣本檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.031,P=0.860);北京市來源和外省市來源肉品檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.802,P=0.005),見表1。

    表1 Y. enterocolitica陽性分離率分布Tab.1 Distribution of isolation rate of Y. enterocolitica isolates

    2.2 菌株毒素檢測結(jié)果和抗生素敏感性檢測結(jié)果 19株分離自生豬肉的Y.enterocolitica對15種抗生素耐藥率由高至低依次為CFZ:94.74%(18/19),AMP:84.21%(16/19),CFX:47.39%(9/19),AMS:42.11%(8/19),NAL:15.79%(3/19),CIP:5.26%(1/19),TET:5.26%(1/19),CAZ:5.26%(1/19),優(yōu)勢耐藥譜為AMP+CFZ聯(lián)合耐藥,耐藥譜見表2。2種方法(傳統(tǒng)PCR和多重?zé)晒釶CR)檢測19株生豬肉分離株5種毒力基因結(jié)果具有一致性,且19株Y.enterocolitica攜帶毒力基因特征均為ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-;2種方法檢測北京順義地區(qū)2017-2019年腹瀉病例中分離到3株Y.enterocolitica5種毒力基因結(jié)果也具有一致性,見表2。

    表2 Y. enterocolitica耐藥譜和毒力基因分布Tab.2 Antibiotic resistance spectrum and virulence gene distribution of Y. enterocolitica isolates

    2.3 菌株分子分型結(jié)果 19株Y.enterocolitica全部進(jìn)行PFGE分子分型檢測,其中2株條帶降解,其余17株成功獲得PFGE指紋圖譜。17株Y.enterocolitica與國家致病菌識別網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中北京順義地區(qū)曾上傳的3個(gè)病例株(BJSY2017Ye001、BJSY2018Ye001、BJSY2019Ye001)進(jìn)行聚類分析,其中Yes-2019bjsy004和Yes-2019bjsy025為不同采樣時(shí)間、不同采樣地點(diǎn)、但卻是同一食品加工企業(yè)生產(chǎn)的2份生豬肉樣品所分離,菌株帶型一致;Yes-2020bjsy031和Yes-2020bjsy032為同一市場、同一攤位采集的2份生豬肉樣品所分離,分離菌株帶型一致;Yes-2019bjsy(ZC)003和Yes-2019bjsy(ZC)004也為同一市場、同一攤位采集的2份生豬肉樣品所分離,菌株帶型相似程度為95.74%。其余11個(gè)菌株帶型相似程度低,呈分散分布,與本地區(qū)病例分離株不成簇。見圖1。

    圖1 自生肉和病例分離Y. enterocolitica脈沖場凝膠電泳聚類結(jié)果Fig.1 PFGE pattern cluster analysis of Y. enterocolitica isolates from raw meat and patients with diarrhea

    3 討 論

    歐洲的相關(guān)研究中,Y.enterocolitica在生鮮制品的檢出率超過30%[8],但國內(nèi)部分研究,生鮮制品中Y.enterocolitica檢出率僅有10%,甚至低于5%[9-11]。本研究使用傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)法Y.enterocolitica陽性率為8.5%(6/70),而增菌液foxA基因熒光PCR預(yù)篩查陽性率為27.14%(19/70)。增菌液foxA基因預(yù)篩查陽性而培養(yǎng)法陰性的樣品,在增加了從選擇性培養(yǎng)基中挑取可疑菌落的數(shù)量后(20~50個(gè)單菌落),最終全部成功分離到Y(jié).enterocolitica菌株,說明增菌培養(yǎng)法存在因挑取可疑菌落數(shù)不足而造成漏檢的問題,結(jié)合增菌液熒光PCR預(yù)篩查檢測,可顯著提高生豬肉樣品中Y.enterocolitica分離培養(yǎng)陽性率。本研究中發(fā)現(xiàn)4個(gè)季節(jié)Y.enterocolitica檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,超市與市場零售樣品檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但北京市肉源檢出率顯著高于外省市肉源,這可能是北京市肉源相對外省市肉源的銷售周期短,肉制品新鮮程度高相關(guān)。

    本研究中對17株生肉分離株和本地區(qū)2017-2019年3株病例分離株進(jìn)行了分子分型分析,結(jié)果顯示Y.enterocolitica帶型多樣化,無顯著遺傳聚集性特征,且生肉分離株與病例分離株帶型的相似程度低。生豬肉樣品分離Y.enterocolitica遺傳相似程度與食品生產(chǎn)同源性或銷售同源性是否相關(guān),值得在以后的監(jiān)測中深入研究。

    缺少ystA、ail、yadA基因而僅攜帶耐熱性腸毒素B基因(ystB)的Y.enterocolitica菌株無法突破宿主免疫造成感染[12],本次生豬肉樣品中分離19株菌毒力基因攜帶特征均為ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-,是非致病生物1A型Y.enterocolitica最常見的毒力基因攜帶特征[12-13],用Y.enterocolitica菌種水平識別來評估食品的致病風(fēng)險(xiǎn)存在一定局限,增加ail、ystA、yadA等毒力基因檢測,對提升Y.enterocolitica食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測具有一定意義。菌株毒力基因的熒光PCR組合檢測可快速獲得分離菌株的毒力特征,值得廣泛推廣。

    本研究中Y.enterocolitica對青霉素類(氨芐西林)和一代頭孢(頭孢唑林)耐藥率較高,與國內(nèi)類似研究結(jié)果相似[14-16]。王聞卿等報(bào)道上海食源性Y.enterocolitica分離株對三代頭孢、氟喹諾酮等抗生素均敏感[14];本研究中出現(xiàn)耐三代頭孢(頭孢他啶)菌株和耐氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星)Y.enterocolitica各1株,耐喹諾酮類(萘啶酸)Y.enterocolitica3株,且北京市順義區(qū)2017和2019年均分離到同時(shí)耐頭孢他啶、萘啶酸和環(huán)丙沙星的病例株,2017年病例株同時(shí)耐碳青霉烯類抗生素(亞胺培南);三代頭孢、喹諾酮/氟喹諾酮類、碳青霉烯類等臨床常用抗生素對Y.enterocolitica感染的治療效果可能會(huì)降低[16]。Y.enterocolitica對三代頭孢、喹諾酮/氟喹諾酮類、碳青霉烯類抗生素的耐藥進(jìn)展應(yīng)引起臨床、畜牧、公共衛(wèi)生等部門的關(guān)注,應(yīng)加強(qiáng)Y.enterocolitica耐藥表型及耐藥基因相關(guān)監(jiān)測工作。

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