深圳市408份不同來(lái)源樣本彎曲菌的檢測(cè)及耐藥特征分析

馬艷萍，鞠長(zhǎng)燕，劉 敏，段永翔，何嬌明，馬佳智，俞慕華，張茂俊

彎曲菌為人獸共患病原菌，廣泛寄生于畜禽類(lèi)動(dòng)物以及人類(lèi)的腸道內(nèi)。大部分彎曲菌感染可引起人類(lèi)急性腹瀉性腸炎，特異菌型菌株的感染會(huì)引起格林巴利綜合征、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家彎曲菌感染導(dǎo)致的腸炎占首位，彎曲菌的感染現(xiàn)狀已經(jīng)超過(guò)臨床上常見(jiàn)腸道致病菌(沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌等)，彎曲菌同時(shí)也是這些發(fā)達(dá)國(guó)家食源性病原菌感染的主要監(jiān)測(cè)病原菌[2]。

我國(guó)以前使用傳統(tǒng)方法分離彎曲菌，檢出率很低。2016年開(kāi)始使用濾膜法進(jìn)行彎曲菌的分離培養(yǎng)，分離率大幅提高[3-4]。北京順義地區(qū)腹瀉病人彎曲菌的分離率由2014—2016年0%增加到10.48%[4]。2016年深圳地區(qū)禽肉和腹瀉病人空腸彎曲菌分離率分別為40.7%和5.5%[3,5]，但目前國(guó)內(nèi)外蔬菜、海鮮的彎曲菌檢出少見(jiàn)報(bào)道。

2019年本課題組應(yīng)用過(guò)濾法對(duì)深圳市腹瀉病人，雞肉、雞盲腸、牛肉、豬肉、生菜和海鮮7種不同來(lái)源樣本進(jìn)行彎曲菌的流行與耐藥特征分析，與往年菌株的耐藥特征進(jìn)行比對(duì)，獲得深圳地區(qū)彎曲菌的流行現(xiàn)狀及耐藥變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 本課題組從2019年6—9月共收集不同來(lái)源樣本408份，包括腹瀉病人159份、雞肉69份、雞盲腸50份、牛肉30份、豬肉30份、生菜31份和海鮮39份。

1.1.2 試劑與儀器 彎曲菌檢測(cè)試劑盒(ZC-CAMPY-001，青島中創(chuàng)生物科技有限公司)，彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測(cè)試劑盒(ZC-CAMPY-013，青島中創(chuàng)生物科技有限公司)，彎曲菌瓊脂基礎(chǔ)(Karmali)(Oxoid公司)，彎曲菌 (食源性彎曲菌屬、空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、紅嘴鴨彎曲菌) 四重核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(深圳生科源有限公司)，4950E三氣培養(yǎng)箱(NUAIRE公司)，CFX96 Touch 熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)，全自動(dòng)核酸提取工作站(羅氏公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

1.2.1.1 病人納入標(biāo)準(zhǔn) 執(zhí)行WS271-2007《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》中感染性腹瀉診斷依據(jù)。取綠豆大小的糞便放入糞便樣本采集液，2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.1.2 肉類(lèi)樣本及生菜樣本 稱(chēng)取樣本250 g放于一次性無(wú)菌密封袋中，取出試劑盒中的BPW緩沖液，稀釋10倍后適量加入到袋中淹沒(méi)樣品反復(fù)揉搓，充分漂洗后，放4 ℃過(guò)夜。

1.2.1.3 雞盲腸樣本 從屠宰場(chǎng)用無(wú)菌密封袋收集雞整個(gè)腸部，2 h送回實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室用無(wú)菌鑷子剪下雞盲腸部分，加入到稀釋10倍的BPW緩沖液。

1.2.2 增菌及分離 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，吸取1 mL樣本采集液或漂洗液加于4 mL促生長(zhǎng)增菌液中，37 ℃微需氧(5% O2，10% CO2，85% N2)培養(yǎng)24 h，吸取600 μL滴加雙孔板(Karmali和哥倫比亞血平板)的濾膜上，約1 h后揭去濾膜，翻轉(zhuǎn)平板，置于微需氧環(huán)境37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 四重PCR檢測(cè)和鑒定 用接種環(huán)刮取雙孔板上單菌落純培養(yǎng)(至少挑取5個(gè))，DNA核酸提取采用Roche機(jī)器提取試劑盒。采用彎曲菌四重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行彎曲菌的鑒定。

1.2.4 藥敏方法 藥敏試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法為基礎(chǔ)的試劑盒，成品試劑盒將11種含有不同濃度抗生素的MH瓊脂包被到96孔板中，獲得彎曲菌的最小抑菌濃度(MIC)。質(zhì)控菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的空腸彎曲菌(ATCC33560)。采用2014年美國(guó)國(guó)家耐藥監(jiān)測(cè)中心(National Antimicrobial Resisitance Monitoring System, NARMS)(http://ars.usda.gov/Main/docs.htm.docid=6750)細(xì)菌耐藥標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷彎曲菌的敏感、中介、耐藥。彎曲菌菌株對(duì)三類(lèi)及三類(lèi)以上抗生素耐藥特征為多重耐藥性。

1.3 結(jié)果分析 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間計(jì)數(shù)資料的比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 彎曲菌的分離情況與流行病學(xué)分析 采集408份不同來(lái)源的樣本，不同來(lái)源樣本的分離率見(jiàn)表1，其中雞盲腸的彎曲菌陽(yáng)性率最高，達(dá)72.0%(36/50)，雞肉的分離率次之，為49.3%(34/69)。腹瀉病人彎曲菌分離率為10.7%(17/159)。牛肉、豬肉彎曲菌分離率低，海鮮中分離到1株空腸彎曲菌，生菜未分離到彎曲菌。

表1 不同來(lái)源樣本彎曲菌分離數(shù)及陽(yáng)性率Tab.1 Number and positivity rates of Campylobacter isolated from different samples

共采集腹瀉病人糞便樣本159份，彎曲菌陽(yáng)性率為10.7%(17/159)。17株彎曲菌中，空腸彎曲菌13株，結(jié)腸彎曲菌2株，簡(jiǎn)明彎曲菌2株。彎曲菌陽(yáng)性病例臨床表現(xiàn)主要為腹瀉，其中糊狀便占76.5%(13/17)，水樣便占17.6%(3/17)，成型便占5.9%(1/17)。腹瀉病人不同年齡組存在差異，46歲以上年齡組彎曲菌陽(yáng)性率(27.8%)高于10～45歲年齡組(7.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.352，P=0.037)。

2.2 菌株抗生素敏感性特征 13株腹瀉病人和40株雞源空腸彎曲菌菌株耐藥結(jié)果見(jiàn)表2。2種來(lái)源空腸彎曲菌菌株對(duì)萘啶酸、環(huán)丙沙星和四環(huán)素的耐藥率均高于90%。值得注意的，2種來(lái)源空腸彎曲菌菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥率均高于75%?？漳c彎曲菌的總體耐藥梯度為喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素、氯霉素類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)。53株空腸彎曲菌菌株有39株存在多重耐藥性(11株人源，28株雞源)，其中有8株(人源2株，雞源6株)空腸彎曲菌對(duì)11種抗生素全部耐藥。腹瀉病人來(lái)源和雞源空腸彎曲菌常見(jiàn)的耐藥譜為萘啶酸-環(huán)丙沙星-四環(huán)素-氟苯尼考，耐藥率分別為69.2%(9/13)和65%(26/40)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P=1.000)。

表2 13株腹瀉病人和40株雞源空腸彎曲菌菌株耐藥結(jié)果Tab.2 Drug resistance of 13 patients with diarrhea and 40 Campylobacter jejuni strains from chickens

2株腹瀉病人和30株雞源結(jié)腸彎曲菌菌株耐藥結(jié)果見(jiàn)表3。32株結(jié)腸彎曲菌菌株對(duì)萘啶酸、環(huán)丙沙星和四環(huán)素全部耐藥。值得注意的是，32株結(jié)腸彎曲菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率高達(dá)62.5%(20/32)。32株結(jié)腸彎曲菌菌株全部存在多重耐藥性，其中4株雞源結(jié)腸彎曲菌對(duì)11種抗生素全部耐藥。

表3 2株腹瀉病人和30株雞源結(jié)腸彎曲菌菌株耐藥結(jié)果Tab.3 Drug resistance results of two strains of Campylobacter coli isolated from patients with diarrhea and 30 strains from chickens

注：ERY：紅霉素；AZI：阿奇霉素；NAL：萘啶酸；CIP：環(huán)丙沙星；GEN：慶大霉素；STR：鏈霉素；CHL：氯霉素；FLO：氟苯尼考；TET：四環(huán)素；TEL：泰利霉素；CLI：克林霉素。圖1 2種來(lái)源彎曲菌的耐藥譜Fig.1 Drug resistance spectrum of Campylobacter from two sources

2.3 與往年彎曲菌的流行及耐藥特征的比對(duì)分析 2019年腹瀉病人來(lái)源空腸彎曲菌分離率和2016年(5.3%，23/437)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.743，P=0.187)。2019年雞肉來(lái)源空腸彎曲菌分離率和2016年(36.5%，23/63)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.313，P=0.576)。

2019年腹瀉病人分離的空腸彎曲菌菌株萘啶酸-環(huán)丙沙星-四環(huán)素-氟苯尼考多重耐藥(69.2%，9/13)高于2016年(30.4%，7/23)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.063，P=0.024)。

3 討 論

污染的禽畜類(lèi)動(dòng)物是人類(lèi)彎曲菌感染的主要來(lái)源[6]。本研究中，深圳地區(qū)雞肉與雞盲腸中彎曲菌檢出率較高，為49.3%和72%，牛肉、豬肉、生菜和海鮮中彎曲菌的檢出率較低(≤3.3%)。2020年Zbrunab等[7]的meta分析表明雞是彎曲菌的主要傳染源，與本研究結(jié)果一致。2016年本課題組雞肉、牛肉中空彎曲菌檢出率分別為36.5%、1.1%[3]。四川省雞盲腸、江蘇省、山東省青島市雞肉彎曲菌檢出率分別為56.1%、46.7%、34.66%[8-10]。西班牙北部雞肉、雞糞彎曲菌檢出率分別為35.4%、62%[11]。上述國(guó)內(nèi)外雞肉和雞糞(雞盲腸)中彎曲菌檢出均低于本研究，說(shuō)明深圳地區(qū)雞源彎曲菌污染嚴(yán)重，且呈遞增趨勢(shì)。深圳地區(qū)豬源彎曲菌污染(3.3%，1/30)低于中國(guó)東部地區(qū)(19.3%，333/1 726)[12]。彎曲菌在法國(guó)某海岸線的貝類(lèi)樣品中檢出率為26.6%[13]。本研究深圳地區(qū)生菜中未檢出彎曲菌，39份海鮮樣品檢出1株空腸彎曲菌，中國(guó)其他地區(qū)生菜和海鮮樣品彎曲菌的檢出率未見(jiàn)報(bào)道。

2019年腹瀉病人空腸彎曲菌分離率(8.2%)與2016年(5.3%)進(jìn)行比較，空腸彎曲菌分離陽(yáng)性率增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.743，P=0.187)。雞源空腸彎曲菌的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明2016—2019年3年深圳地區(qū)腹瀉病人和雞源空腸彎曲菌的感染無(wú)明顯變化。2017—2018年北京地區(qū)腹瀉人群中彎曲菌的檢出率為7.81%[14]，與本研究差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。值得注意的是，深圳地區(qū)46歲以上年齡組彎曲菌分離率(27.8%)高于(10～45歲)年齡組(7.9%)，這與2017年北京順義地區(qū)(彎曲菌感染以16～30歲病例居多，達(dá)14.5%)[4]和加納地區(qū)彎曲菌的分離(以10～29歲年齡組為主，為34.3%)[15]有差異，說(shuō)明彎曲菌的感染存在地區(qū)和年齡差異。

印度地區(qū)雞盲腸來(lái)源彎曲菌耐藥從高到低依次為喹諾酮類(lèi)(>90%)、四環(huán)素(39.3%)、紅霉素(13.4%)，而對(duì)氯霉素、鏈霉素和慶大霉素敏感(耐藥<2%)[16]。本研究雞源彎曲菌對(duì)抗生素的耐藥率除喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素高于90%，其他幾種抗生素耐藥率均高于30%。說(shuō)明深圳地區(qū)彎曲菌耐藥現(xiàn)象比印度地區(qū)更嚴(yán)重。2019年雞源空腸彎曲菌對(duì)紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素和克林霉素的耐藥高于2016年，且腹瀉病人分離的空腸彎曲菌對(duì)萘啶酸-環(huán)丙沙星-四環(huán)素-氟苯尼考多重耐藥(69.2%，9/13)高于2016年(30.4%，7/23)。說(shuō)明深圳地區(qū)彎曲菌耐藥現(xiàn)象增強(qiáng)，且存在多重耐藥現(xiàn)象，尤其大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素作為一線抗菌藥物[17]，耐藥性也在增加，應(yīng)引起廣大部門(mén)的注意。

本研究腹瀉病人來(lái)源彎曲菌對(duì)氟苯尼考抗生素存在高耐藥性(空腸彎曲菌為76.9%，結(jié)腸彎曲菌為50.0%)。北京順義地區(qū)腹瀉病人來(lái)源空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌對(duì)氟苯尼考耐藥率分別為46.05%和0[18]。RE-Cme ABC外排泵可能是導(dǎo)致近幾年氟苯尼考在禽畜空腸彎曲菌高耐藥的原因[19]。氟苯尼考一直在禽畜中使用，但在人源中也有較高的耐藥率，需要進(jìn)一步研究其在人源中產(chǎn)生耐藥的原因。