結核分枝桿菌PE/PPE蛋白家族生物學研究進展

王 璞，蔡玉榮，張 剛，孔云逸，穆愛娟，李 勇

結核分枝桿菌(MTB)是一種引起人獸共患的傳染性疾病的病原菌。與其他病原菌相比，MTB不產生毒素，其致病物質主要是莢膜成分、脂類以及蛋白質，尤其是MTB基因組上有許多表達蛋白質的基因[1]，其中許多蛋白(家族)是與細菌致病性相關的毒力因子。近年來研究發(fā)現，MTB基因組上存在一個特殊的富含甘氨酸的基因家族——PE/PPE基因家族，約占基因組編碼區(qū)的10%，共編碼168個蛋白。這些蛋白家族成員在MTB的細菌毒力、亞細胞定位、細菌免疫逃逸、宿主細胞的命運中起關鍵作用。當MTB經呼吸進入肺泡時，PE/PPE蛋白家族成員能介導MTB的粘附和侵襲宿主肺泡中的巨噬細胞[2-3]，并且JNK MAPK、NF-κB等信號分子參與了PE/PPE蛋白介導的病原與宿主免疫細胞之間的相互作用。此外，PE/PPE蛋白還可作為潛在的特異性診斷試劑和抗結核疫苗的成分。本文將圍繞上述內容作一綜述和展望，以期為MTB的臨床致病機理和防控提供理論參考。

1 PE/PPE蛋白家族的結構特征

PE/PPE蛋白家族以其N末端結構域中的保守脯氨酸(P)和谷氨酸(E)殘基命名，PE蛋白存在Pro-Glu(PE)基序，PPE蛋白存在Pro-Pro-Glu(PPE)基序，這些基序都是MTB毒力因子和T細胞抗原的重要表位。PE/PPE蛋白的N末端是高度保守的，PE蛋白N端大約由110個氨基酸組成，PPE蛋白大約由180個氨基酸組成，形成α-β-α的螺旋束結構，但C端序列呈高度多態(tài)性，變異較大，且在感染過程中選擇性表達，這有利于病原體逃避宿主的攻擊，因此C端基因的突變可能會導致MTB毒力的減弱[4]。

PE/PPE蛋白家族包含69個PPE蛋白成員以及99個PE蛋白成員，根據C末端結構域的同源性和特異性基序進行分類，其中PPE蛋白可分為4個亞家族，分別是PPE_SVP(帶有Gxx-SVPxxW基序)，PPE_PPW(帶有PxxPxxW基序)、PPE_MPTR(多肽串聯重復序列)和沒有特征的PPE；PE蛋白分為2個亞家族，PE和PE_PGRS(polymorphic GC-rich-repetitive sequence，富含GC的多態(tài)性重復序列)[5]。Phan等[6]發(fā)現，PE基因的下游是PPE基因，PPE蛋白通過N末端的3個疏水性α螺旋與其PE蛋白相互作用，并以異二聚體形式分泌。這種異二聚體結構將PPE蛋白的保守序列WxG和PE蛋白的YxxxD/E序列緊密相連，而這些序列可能是Type Ⅶ(Type Ⅶ secretion system, T7SS)分泌的識別結構[7]。這種PE和PPE的結構類似于ESX蛋白形成的異二聚體的結構，例如ESAT-6HE CFP10。這些數據表明，螺旋束結構和復合分泌信號是PE和PPE異二聚體以及其他與Type Ⅶ型相關底物的結構特征。

PE/PPE蛋白主要存在于致病性分枝桿菌，在非致病性結核分枝桿菌中的含量較少，因此PE/PPE蛋白可能在分枝桿菌的毒力、發(fā)病機制中起獨特的作用。

2 PE/PPE蛋白家族的生物學功能

目前已報道MTB的PE/PPE蛋白家族成員中有超過35種定位于分枝桿菌細胞膜或細胞壁上，與細胞壁相關的蛋白可能介導病原體-宿主的相互作用，所以細胞定位可能參與調控MTB不同的生物學功能[8]，其中一些PE/PPE蛋白可以攻擊宿主的免疫系統，影響MTB的毒力，促進MTB在胞內的定殖，或與宿主細胞競爭性獲取鐵等[9]。

2.1 MTB的毒力調控 研究發(fā)現，PE/PPE蛋白可調控MTB的毒力。最新研究結果表明[10]，利用MTB H37Rv的野生株(WT)、PPE25-PE19突變株和△PPE25-PE19：：esx-5回補株分別以1×104CFU/只的劑量通過鼻內途徑感染C57BL/6小鼠，結果發(fā)現，在感染后28 d，△PPE25-PE19突變株僅觀察到巨噬細胞和淋巴細胞對支氣管和血管周圍浸潤較小且沒有發(fā)現MTB。而在△PPE25-PE19：：esx-5回補株感染的小鼠肺中發(fā)現巨噬細胞、上皮細胞、淋巴細胞和漿細胞的廣泛浸潤，并且檢測到MTB的大量增殖。這些數據表明，PPE25-PE19作為MTB的致病因子增加了細菌的毒力、感染、增殖以及致病性等能力。另外有研究發(fā)現，MTB的ESX-5分泌系統分泌的PE_PGRS和PPE_MPTR蛋白可降低MTB的毒力。PPE38的功能突變可以完全阻斷這2個亞家族的分泌，在北京譜系的臨床MTB中發(fā)現具有這種突變，并伴隨著分泌蛋白的喪失。在中等致病性MTB中，PPE38缺失株會導致細菌負荷和炎癥因子的顯著增加，從而增強了細菌毒力，這表明ESX-5底物在毒力衰減作用中起著重要的作用，但無法揭示ESX-5底物對PPE38的依賴機制[11]。

2.2 MTB在巨噬細胞內的存留時間 PE/PPE蛋白為了劫持宿主巨噬細胞并在細胞內存活，MTB需要模擬宿主蛋白質功能，以此調節(jié)宿主細胞的命運。MTB膜蛋白中的PE/PPE蛋白(如：PPE39、PE_PGRS11、PE9等)可直接與巨噬細胞TLR2/4受體發(fā)生相互作用，并改變其胞內環(huán)境，從而有利于延長細菌的生存時間。研究發(fā)現，用表達PE_PGRS33的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis，M.s)通過腹腔感染C57BL/6小鼠，結果顯示小鼠骨髓巨噬細胞的存活率增加，使得M.s在巨噬細胞內的存留時間延長，這可能是此類蛋白可以通過抗原變異或抑制MHC I(major histocompatibility complex I，MHC I)類分子的呈遞，從而在宿主細胞中持續(xù)存在。據此推測，PE_PGRS蛋白可能與MTB自身的免疫逃逸機制有關[12]。Mi等[13]用M.s_PPE26感染BALB/c小鼠，6 d后取小鼠的肝，脾和肺組織來確定其細菌負荷量，發(fā)現在感染 6 d后，細菌負荷量減少，這些結果表明在非致病性M.s中表達PPE26可使M.s在小鼠巨噬細胞中的存活率升高。另外，在MTB還發(fā)現PE4、PE5和PE15等蛋白可通過抑制一氧化氮合酶(iNOS)的合成從而終止亞硝化應激[14]，使宿主巨噬細胞保持完整的結構，從而延長MTB在巨噬細胞內的存活時間。

2.3 競爭性獲取宿主細胞鐵離子 鐵離子是人體的固有微量元素之一，從宿主細胞獲取鐵離子對于MTB的復制和毒力調控具有重要作用。鐵離子通常被螯合在宿主細胞內，在感染過程中，MTB通過鐵載體介導的鐵獲取(SMIA)和血紅素鐵獲取(HIA)這2種途徑從中獲取鐵。當鐵載體生物合成受到干擾時，SMIA缺陷的MTB突變體在含有130 μmol/L Fe3+的標準7H9培養(yǎng)基中不會出現持續(xù)的生長，會在存儲鐵耗盡時停止生長，而添加外源鐵載體后可恢復MTB生長。另外，研究發(fā)現，對血紅素鐵的獲取可能在MTB致病過程中起關鍵作用。PPE36、PPE62蛋白可結合血紅素，然后血紅素加氧酶在細胞內降解血紅素以釋放Fe2+；此外，PPE37也參與了血紅素的攝取[15]，但不參與鐵降解與釋放，此機制有待進一步研究。因此在分枝桿菌致病過程中血紅素鐵獲取起關鍵作用，重要PE/PPE蛋白功能見表1。

表1 重要PE/PPE蛋白的功能Tab.1 Important PE/PPE protein function

3 對宿主免疫反應的調控

3.1 調控宿主先天免疫反應 機體先天具有正常的生理防御功能，可對MTB的入侵作出相應的免疫應答，其中，作為先天免疫的重要吞噬細胞，巨噬細胞的防御機制就是通過吞噬體的成熟和酸化，來殺死病原體，但是MTB中的PE/PPE蛋白可能破壞這一機制并引起宿主巨噬細胞的自噬、凋亡，最終使得MTB存活。

3.1.1 巨噬細胞的抑制 PE_PGRS47在調控MTB抗宿主的先天免疫中可能是一個功能性，非冗余的細菌因子，可通過對自噬的抑制來影響MTB的生存策略和免疫逃避。Saini NK等[36]通過對PE_PGRS47感染巨噬細胞呈遞MHC Ⅱ類分子進行全基因組篩選發(fā)現，PE_PGRS47(Rv2741)抑制了抗原呈遞和巨噬細胞自噬，并對PE_PGRS47基因進行靶向破壞進而導致MTB在體外和體內生長減慢。當用PE_PGRS47的MTB突變體感染小鼠巨噬細胞系RAW264.7時，MHC Ⅱ類分子呈遞增加，RAW264.7細胞內LC3與細菌共定位增加，這些結果表明PE_PGRS47可抑制巨噬細胞的自噬。另外，分泌型PE_PGRS和PPE_MPTR蛋白是調節(jié)巨噬細胞反應的主要毒力效應蛋白。PE_PGRS30就是通過抑制吞噬體融合從而在宿主細胞中存活下來。從鳥分枝桿菌中敲除PPE25基因，可減少巨噬細胞內MTB的復制并抑制吞噬體融合。由此可知，MTB可依靠專門的分泌途徑來分泌毒力效應蛋白，它們可以利用一系列的致病性效應物調節(jié)宿主蛋白并通過抑制吞噬體的酸化和成熟，進而在宿主免疫細胞(主要是巨噬細胞)中存活并復制[37]。

MHC ⅠⅡ：Antigen-presenting cell；ER stress：endoplasmic reticulum stress.圖1 PE/PPE蛋白調節(jié)宿主天然免疫反應Fig.1 PE/PPE proteins regulate the host's natural immune response

3.1.2 巨噬細胞凋亡 MTB對細胞凋亡的抑制有助于延長宿主細胞的生存，從而維持其在宿主中的持久性滯留與增殖，并進行全身性的傳播。通常MTB可能會在感染的早期階段阻止細胞凋亡，使其在營養(yǎng)豐富的宿主細胞環(huán)境中得到復制；到后期，由于宿主營養(yǎng)缺乏，生長受限從而誘導細胞凋亡[38]。例如，Deng等[39]用Ms_PE_PGRS41感染THP-1巨噬細胞，結果表明THP-1中caspase-3和caspase-9的裂解均降低，當過表達PE_PGRS41時，可抑制M.s感染的THP-1巨噬細胞的凋亡。Long等[26]用Ms_Vec和Ms_PE_PGRS62感染PMA分化的巨噬細胞，并使用Annexin-V-FITC和PI檢測細胞凋亡水平，結果表明，與空載體對照Ms_Vec相比，Ms_PE_PGRS62早/晚期凋亡率下降，這些數據表明PE_PGRS62可以抑制巨噬細胞的凋亡。

PE/PPE蛋白質家族成員的C末端還有誘導巨噬細胞凋亡的作用，如：PPE37的C末端可誘導依賴于caspase-3的宿主細胞凋亡[40]，這可能是在凋亡小泡受保護環(huán)境下，MTB繁殖的生存策略。在MTB感染的細胞中，抗原呈遞細胞的凋亡是一種可以啟動宿主先天性免疫應答的防御機制，Gastelum-Avina等[41]發(fā)現PE_PGRS33的PGRS結構域通過與TLR2相互作用改變細菌形態(tài)并介導MTB侵入巨噬細胞，誘導腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)的分泌、增加凋亡標記物乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，進而來觸發(fā)巨噬細胞凋亡，推測PGRS結構域的多態(tài)性影響了PE_PGRS33觸發(fā)了巨噬細胞分泌TNF-α的能力。

3.1.3 內質網(ER)應激的激活 在內質網應激過程中，X-盒結合蛋白1(XBP-1)是未折疊蛋白反應中的一個關鍵限速調控因子，參與內質網內環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及細胞結構完整性等方面的調控。為研究PPE32、內質網應激和細胞凋亡之間的關系，用PPE32刺激人巨噬細胞THP-1，檢測XBP-1的表達和主要分子伴侶蛋白的激活，發(fā)現78-kDa葡萄糖調節(jié)蛋白(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)與ER應激相關，推測PPE32誘導了ER應激相關蛋白GRP78的表達，從而引起巨噬細胞的凋亡[17]。

Sonam等[42]用PE_PGRS5的PGRS域轉染RAW 264.7巨噬細胞，發(fā)現PE_PGRS5的PGRS結構域有助于ER定位并激活ER應激途徑。在RAW 264.7細胞中檢測到Ca2+水平增加，與ER應激誘導的細胞凋亡過程中關鍵蛋白GRP78/GRP94和CHOP/ATF4的表達量顯著增加，從而破壞了細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)，導致NO和ROS的生成，結果表明PE_PGRS5蛋白中PGRS域誘導了GRP78/GRP94和CHOP/ATF4的表達，進而導致巨噬細胞凋亡，見圖1。

3.2 調控宿主獲得性免疫反應 PE/PPE蛋白家族能夠誘導T細胞免疫反應，而樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)的活化是引起該免疫反應的關鍵。未成熟的DC攝取抗原后會發(fā)生遷移，通過淋巴管進入局部淋巴結，進而分化為成熟的DC，提呈抗原并激發(fā)T細胞免疫應答。例如，PE27就是通過上調CD80、CD86、MHC I類和MHC II類分子的表達來活化DC，且伴隨著TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70的分泌增加，從而引起Th1細胞極化[43]。

PE/PPE蛋白家族可以通過誘導未成熟DC細胞向Th1細胞極化，并參與炎癥反應的調控。Choi等[44]研究發(fā)現，PPE39蛋白可通過MAPK和NF-κB信號通路介導DC的活化，活化的DC可以促進CD4+T細胞增殖并伴隨著IFN-γ和IL-2的分泌，以及Th1型細胞相關轉錄因子T-bet的增加，但與Th2相關的GATA-3表達卻沒有增加，這說明PPE39與DC相互作用誘導偏向Th1型的細胞免疫反應[44]。近期PPE22，Rv1485也被發(fā)現具有保護功效[45]，分析PE/PPE蛋白PPE22(最強的候選者)的抗原決定簇，鑒定出其N末端有一個可發(fā)生免疫反應的抗原表位，使得細菌負荷量降低，通過評估IgG2a/IgG1比例和細胞因子的釋放，結果表明PPE22，Rv1485誘導保護性Th1免疫反應。PPE57和PPE26介導巨噬細胞的活化并以TLR2依賴性方式觸發(fā)Th1型免疫反應。Xu Y等[46]發(fā)現PPE57和PPE26與TLR2相互作用，可促進細胞表面分子(CD40，CD80，CD86和MHC Ⅱ類)和TNF-α，IL-6和IL-12p40的表達，進而觸發(fā)由MAPK和NF-κB信號通路介導的巨噬細胞活化。另外，PPE57和PPE26在體內可有效介導T細胞極化以分泌IFN-γ和IL-2并增強趨化因子3(CXCR3)的表達。表明這些蛋白質可能在免疫應答過程中也可以促進Th1極化，最終引起宿主炎癥反應。

但也有一些PE-PPE復合物可調節(jié)Th2型的免疫反應，減少促炎細胞因子的產生，這樣有助于細菌在宿主內的存活。然而MTB使用的一種主要的免疫逃避機制就是故意引起Th2免疫反應，反過來下調抗分枝桿菌的Th1反應。Khubaib等[47]發(fā)現用PPE65感染RAW264.7細胞，隨著PPE65濃度的增加，觀察到脾細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ水平降低，與Th2型相關的IgG1顯著增加，這預示著PPE65抑制Th1型免疫反應，使得Th2型的免疫反應占主導地位。因此，PE/PPE蛋白作為潛在的免疫調節(jié)蛋白，可通過平衡Th1/Th2反應來參與MTB感染的建立與維持，從而使MTB在宿主體內存活。

綜上所述，PE/PPE蛋白能夠被宿主免疫系統識別，調節(jié)宿主的先天免疫和獲得性免疫反應[30]。該家族蛋白與巨噬細胞TLRs相互作用，誘導凋亡和炎癥因子的釋放，進而引起T細胞和B細胞免疫應答(圖2)。

圖2 PE/PPE蛋白調節(jié)宿主獲得性免疫的信號轉導Fig.2 PE/PPE proteins regulate the signal transduction of host acquired immunity

4 PE/PPE蛋白作為疫苗靶標

目前用于結核病預防的疫苗為卡介苗，由于卡介苗只能預防兒童的結核性腦膜炎和粟粒性肺結核，而對成人結核病沒有預防作用且對成年動物的免疫效果并不明顯，短時間之內很難提高保護效力。因此，人們對預防結核病的DNA疫苗、亞單位疫苗進行了廣泛的研究，并且亞單位疫苗成為MTB疫苗研究的熱點領域。近年來研究較多的亞單位疫苗的抗原為MTB Ⅶ型分泌系統(ESX-3)分泌的EAST-6、CFP10、Ag85A和Ag85B等，并且只有H56：IC31(EAST-6)、ChAdOx1 85A-MVA85A等進入二期臨床[48]。為了篩選更好的MTB抗原用于結核病疫苗的開發(fā)，MTB分泌系統ESX-5分泌的PE/PPE家族蛋白成為潛在的候選抗原。

當前，以PE/PPE蛋白作為抗原成分的疫苗有M72：AS01E和ID93/GLA-SE，其中M72：AS01E是目前最先進的蛋白質佐劑疫苗，旨在促進BCG誘導的免疫反應，M72抗原由MTB 32A和MTB 39A 重組融合蛋白組成，使用AS01E佐劑刺激免疫系統可以有效地將抗原遞送至抗原呈遞細胞，從而募集單核細胞和中性粒細胞，誘導快速的先天免疫應答[49]。在臨床IIb期試驗中，M72：AS01E疫苗可誘導M72產生特異性抗體和CD4+T細胞的免疫反應，在健康受試者中具有可接受的臨床安全性。

還有一種以Rv3619、Rv3620、Rv1813和PPE42為抗原的亞單位疫苗——ID93/GLA-SE疫苗，該疫苗由四價融合蛋白組成，所使用的佐劑是水包油型乳劑，其中嵌入了TLR4受體激動劑。在臨床前研究中，已發(fā)現ID93/GLA-SE疫苗可有效預防小鼠和豚鼠感染MTB[50]，并增加了IgG1和IgG3抗體的表達，誘導了Th1型細胞的免疫應答。ID93/GLA-SE疫苗已成功在成人Ⅰ期臨床試驗中證明了其安全性和免疫原性，現已進入Ⅱb期臨床試驗。

除進入臨床試驗的PE/PPE蛋白外，還有一種較好的潛在抗原表位蛋白質——PE_PGRS33蛋白[51]，其PE結構域序列可以與MPT64基因序列融合，這種嵌合蛋白能增強對機體的保護，減少MTB對機體的感染，實驗證明可利用這種蛋白質來開發(fā)抗結核病疫苗。雖已有多個候選疫苗已進入臨床實驗(PPE44，PPE38，PPE32，PPE18[33]等)，但是新型結核病疫苗的開發(fā)仍面臨著許多挑戰(zhàn)，例如，缺乏清晰的保護性抗原、缺乏合適的動物模型、可靠的臨床前評估指標、免疫人群的復雜性等問題。

5 展 望

PE/PPE蛋白的功能研究已有十多年的歷史，與其他分枝桿菌蛋白相比，PE/PPE蛋白的生物學結構仍然知之甚少?，F如今需要關注的領域包括PE/PPE結構生物學、PE/PPE宿主靶標的識別、病原體與細胞的相互作用以及對這些蛋白調節(jié)宿主免疫反應的機制。PE/PPE蛋白的結構生物學是一個亟待研究的領域，清晰的PE/PPE蛋白的結構可以確定PE/PPE蛋白的宿主靶標，更能全面地了解PE/PPE蛋白發(fā)生變異的抗原表位、對宿主的感染機制，免疫逃逸以及如何導致MTB的致病性等。這對于深入了解結核分枝桿菌的毒力非常重要，預示著PE/PPE蛋白可能是疫苗和新藥靶標的來源，可成為抗結核病疫苗的組成部分。