2019—2020年山東省H3N2流感病毒抗原性及血凝素基因特征分析

吳巨龍，呂 健，寇增強(qiáng)，宋紹霞，孫 林，何玉潔，劉 倜

流行性感冒是人類最常見的上呼吸道感染性疾病之一，由流感病毒引起。流感病毒根據(jù)其核蛋白和膜蛋白的抗原特性不同可以分為甲、乙、丙3型流感病毒。目前，甲型流感病毒根據(jù)其表面的血凝素(HA)抗原的不同可分為18個亞型，根據(jù)神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原的不同可以分為11個亞型[1]。H3N2流感病毒于1968年開始在人類中傳播以來，一直是季節(jié)性流感流行的1個主要亞型，季節(jié)性H3N2流感具有潛伏期短且傳播速度快的流行特點(diǎn)，并且主要在人際間傳播，全年各個季節(jié)都會發(fā)生感染病例，且每隔3～8年便會出現(xiàn)新的抗原漂變株[2]。血凝素(HA)作為流感病毒的重要抗原，可以與細(xì)胞表面病毒特異性受體結(jié)合并且刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[3]。病毒的抗原位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)均位于HA上[4]，因此對HA的變異研究尤為重要。本研究擬通過對2019—2020年流感監(jiān)測年度山東省分離株流感病毒進(jìn)行抗原性及HA基因特性分析，了解該亞型毒株的變異趨勢，為流感的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株收集 依據(jù)國家流感中心規(guī)定，每年4月1日所在周至次年4月1日所在周前一周為一個流感監(jiān)測年度，因此2019—2020年流感監(jiān)測年度的采樣日期為2019年4月1日至2020年3月29日。采集此期間山東省各國家級哨點(diǎn)醫(yī)院流感樣病例標(biāo)本，采用犬腎細(xì)胞(MDCK)進(jìn)行流感病毒分離。所有毒株均經(jīng)過山東省疾控中心復(fù)核鑒定后用于本研究分析。我們將此期間收檢的甲型H3N2流感病毒根據(jù)病毒的采樣日期和分離地點(diǎn)隨機(jī)選取40株病毒用于抗原性分析，并對其中19株病毒進(jìn)行測序。

1.2 流感病毒的抗原分析 標(biāo)準(zhǔn)參考抗原為WHO推薦的2019—2020年北半球疫苗株A/Kansas/14/2017，其免疫雪貂后的抗血清作為標(biāo)準(zhǔn)參考血清。標(biāo)準(zhǔn)參考抗原及標(biāo)準(zhǔn)參考血清均由中國疾控中心提供。利用紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)(Hemagglutination inhibition, HI)進(jìn)行抗原性分析，紅細(xì)胞采用人“O”型血離心洗滌制備，具體方法按照《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南》(2017版)。

1.3 序列測定 RT-PCR擴(kuò)增核酸提取使用西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒(Lot 20042110T025)；基因擴(kuò)增使用Invitrogen公司的One Step RT-PCR Kit試劑盒，擴(kuò)增引物序列來自國家流感中心，引物合成由上海Invitrogen完成。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海伯杰生物有限公司進(jìn)行雙向測定。

1.4 序列分析 序列拼接使用Velvet、Bowtie2和Sam tools軟件。序列比對使用MEGA.6軟件的Clustal W方法，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建種系進(jìn)化樹。通過NetNGlyc 1.0 Server糖基化位點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站對潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行在線預(yù)測分析。本研究從全球共享流感數(shù)據(jù)倡議組織GISAID網(wǎng)站下載WHO2014年以來推薦的甲型H3N2亞型流感北半球疫苗株HA序列作為進(jìn)化樹構(gòu)建骨架，包括A/Texas/50/2012(2014—2015年疫苗株)、A/Switzerland/9715293/2013(2015—2016年疫苗株)、A/Hong Kong/4801/2014(2016—2018年疫苗株)、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(2018—2019年疫苗株)、A/Kansas/14/2017(2019—2020年疫苗株)、A/Hong Kong/2671/2019(2020—2021年疫苗株)。

2 結(jié) 果

2.1 抗原性分析 本次實(shí)驗(yàn)參考抗原A/Kansas/14/2017與參考血清自身HI效價為1∶160。所選的40株H3N2毒株與參考血清的HI效價為1∶20的有26株，其余14株中有9株HI效價為1∶40，5株HI效價為1∶80。根據(jù)WHO判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)待檢病毒與參考血清的HI效價低于參考抗原與參考血清自身HI效價的8倍(含8倍)或以上時，則認(rèn)為待檢病毒為該參考血清檢測到的低反應(yīng)株；反之，當(dāng)相差8倍以內(nèi)時(不含8倍)，則認(rèn)為待檢病毒與參考抗原的抗原性類似，為類似株。按照上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，本次實(shí)驗(yàn)所選的40株H3N2毒株與參考株相比，35%(14/40)為A/Kansas/14/2017的類似株，其余65%(26/40)為A/Kansas/14/2017的低反應(yīng)株。

2.2 HA基因同源性分析 用MegAlign軟件對研究分離的19株H3N2亞型流感毒株的HA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示19株分離株HA核苷酸同源性為99.11%～100.0%，氨基酸同源性為98.93%～100.0%。將待檢毒株與疫苗株HA基因序列比對，進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，2019—2020年山東省流感監(jiān)測年度分離的H3N2流感毒株與當(dāng)年推薦的疫苗株A/Kansas/14/2017之間的同源性相對與其他年份疫苗株的同源性較低。待檢毒株與疫苗株之間核苷酸、氨基酸同源性分析及核苷酸遺傳距離結(jié)果，見表1。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，19株分離株與當(dāng)季疫苗株A/Kansas/14/2017在進(jìn)化樹上的距離較遠(yuǎn)，而與2020—2021年疫苗株A/Hong Kong/2671/2019關(guān)系最近，且聚為一個支，全部屬于3C.2a1b分支，見圖1。

表1 19株H3N2亞型流感病毒流行株與疫苗株之間的HA基因同源性分析Tab.1 Homology analysis of the HA gene among 19 H3N2 subtype influenza virus epidemic strains and vaccine strains

▲：WHO推薦的2019-2020年疫苗株；●:WHO推薦的2020-2021年疫苗株；■：WHO之前推薦的疫苗株圖1 2019-2020年山東省測序H3N2流感毒株HA基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the HA genes of H3N2 influenza strains sequenced in Shandong Province from 2019 to 2020

2.3 HA基因氨基酸位點(diǎn)變異分析 H3N2亞型流感病毒HA1蛋白共有A、B、C、D和E 5個抗原決定簇。與疫苗株A/Kansas/14/2017相比較，參與分析的19株流行株均發(fā)生了抗原決定簇位點(diǎn)氨基酸替換，涉及4個抗原決定簇，其替換特征與疫苗株A/Hong Kong/2671/2019有相似，也有不同。所有的19株病毒在A區(qū)135位、137位、144位，B區(qū)159位、160位均不同于疫苗株A/Kansas/14/2017。此外在A區(qū)140位有2株，B區(qū)158位、198位各1株，C區(qū)53位有4株，D區(qū)207位有1株毒株有抗原決定簇位點(diǎn)發(fā)生突變。值得注意的是監(jiān)測毒株A區(qū)135位、137位、144位，B區(qū)159位與最新疫苗株A/Hong Kong/2671/2019一致。E區(qū)未監(jiān)測到變異發(fā)生。見表2。流感病毒受體結(jié)合位點(diǎn)位于HA1蛋白，由左壁(225～228位)、右壁(155位)、前壁(130～137位)、后壁(183位、190位、194位)和底壁(98位、153位)組成[5]。與當(dāng)年疫苗推薦株A/Kansas/14/2017相比較，2019—2020年山東省H3N2流感病毒受體結(jié)合位點(diǎn)變異主要發(fā)生在前壁，所有毒株均出現(xiàn)T135K，S137F變異。

表2 2019-2020年山東省H3N2亞型流感毒株HA基因抗原性位點(diǎn)變異Tab.2 Antigenic variants in the HA gene of influenza A viruses (H3N2) in Shandong Province, 2019-2020

表2(續(xù))毒株名稱抗原決定簇ABCD13513714014415815916019853207A/Shandong-Bincheng/3250/2019KFISNYTSNKA/Shandong-Zichuan/330/2019KFISNYTSDKA/Shandong-Taishan/385/2019(H3)KFISNYTSDRA/Shandong-Dongying/1661/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Donge/38/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Rencheng/122/2020(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Yanzhou/339/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Laiwu/324/2020(H3)KFMSNYTSDKA/Shandong-Mudan/1855/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Zichuan/362/2019(H3)KFMSNYTSDKA/Shandong-Dongchangfu/1719/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Zhifu/18/2020(H3)KFISNYTPDKA/Shandong-Shizhong/1887/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Dongying/1672/2020(H3)KFISNYTSDKA/HongKong/2671/2019KFISNYISDK

2.4 糖基化位點(diǎn)分析 血凝素蛋白的糖基化位點(diǎn)增加或減少對流感病毒的抗原性及其他生物學(xué)特性均有一定影響。疫苗株A/Kansas/14/2017血凝素蛋白共有11個潛在糖基化位點(diǎn)，分別位于第8、22、38、45、63、122、133、165、246、285、483位。與疫苗株A/Kansas/14/2017相比，所有19株毒株在133位有糖基化位點(diǎn)缺失，但有17株毒株在158位點(diǎn)增加了糖基化位點(diǎn)。最新疫苗株A/Hong Kong/2671/2019在133和158位點(diǎn)都沒有潛在糖基化位點(diǎn)。見表3。

表3 2019-2020年山東省H3N2亞型流感毒株HA糖基化位點(diǎn)變異情況Tab.3 Amino acid substitutions in HA gene glycosylation sites of influenza A viruses (H3N2) in Shandong Province, 2019-2020

表3(續(xù))毒株名稱8(NST)22(NGT)38(NAT)45(NSS)63(NCT)122(NES)133(NGT)158(NYT)165(NVT)246(NST)285(NGS)483(NGT)A/Shandong-Rencheng/122/2020??????-?????A/Shandong-Yanzhou/339/2019??????-?????A/Shandong-Laiwu/324/2020??????-?????A/Shandong-Mudan/1855/2019??????-?????A/Shandong-Zichuan/362/2019??????-?????A/Shandong-Dongchangfu/1719/2019??????-?????A/Shandong-Zhifu/18/2020??????-?????A/Shandong-Shizhong/1887/2019??????-?????A/Shandong-Dongying/1672/2020??????-?????A/HongKong/2671/2019??????--????

3 討 論

流感病毒在免疫選擇壓力下，通過HA和NA的堿基置換發(fā)生抗原進(jìn)化，極易變異而引起不同程度的流行[6]。有研究表明，H3N2抗原的長期變異速率，比其他亞型流感病毒進(jìn)化速率更快[7]。這使得季節(jié)性H3N2流感病毒更易引起局部的流行暴發(fā)，對易感人群的危害也更大。疫苗主要是通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體起到對流感病毒的預(yù)防作用，但流感病毒可通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換來對抗宿主的免疫反應(yīng)，流感病毒的頻繁變異導(dǎo)致WHO并不是每次都能準(zhǔn)確預(yù)測疫苗株[8]。若是流感疫苗株對各亞型內(nèi)抗原匹配較好，則產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，對匹配程度較差的毒株保護(hù)效果則有限。不同地區(qū)流感疫苗免疫效果的研究結(jié)果顯示，對于不匹配毒株，流感疫苗的保護(hù)作用普遍較差[9]。

自2009年以來，世界衛(wèi)生組織全球流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)根據(jù)HA基因序列將甲型流感H3N2病毒確定為7個基因組。近年來的研究表明，第3基因組H3N2流感病毒已占主導(dǎo)地位，并已形成亞群[10]。在本次研究中，隨機(jī)選擇的本地季節(jié)性H3N2流行毒株均為3C組，是目前全球流行的主要支系。3C組分為3C.1、3C.2、3C.3 3個亞組，它們在抗原性上總體是相似的，但有差異[10-11]。日本2014-2015年流感季，就是由于主要流行的是3C.2a基因型H3N2病毒，而疫苗株卻是3C.1基因型，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗作用降低[12]。在2017年，3C.2a 基因亞群中又出現(xiàn)了進(jìn)一步變異的集群[13]，與一些國家的疫苗免疫失敗案例有關(guān)[9,14]。

本研究分析了2019年4月至2020年3月間山東省H3N2亞型流感病毒抗原性及血凝素基因特征，通過抗原性分析，發(fā)現(xiàn)僅35%的毒株為疫苗株類似株。這或許與此期間流行的H3N2流感病毒均是屬于3C.2a亞群，而疫苗株屬于3C.3a有關(guān)。通過序列比對還發(fā)現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)所有入選監(jiān)測毒株的HA抗原與疫苗株相比較均出現(xiàn)了5處抗原表位的變異，2處位于前壁的受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸發(fā)生變異。通常認(rèn)為，如果抗原決定簇中的4個以上位點(diǎn)發(fā)生突變，且這些位點(diǎn)分布在2個以上的抗原決定簇上時，表明新的抗原漂變株出現(xiàn)[15]，這時疫苗株的接種就可能會失去對流行株的保護(hù)。此外，血凝素蛋白糖基化位點(diǎn)可以穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，其數(shù)目的增減會影響中和抗體與HA抗原表位的結(jié)合，從而使病毒逃避宿主免疫識別，進(jìn)而影響病毒的抗原性、傳染性和致病性[16]。本研究中所有毒株與2019—2020年疫苗株相比發(fā)生1處糖基化位點(diǎn)缺失(19/19)，1處糖基化位點(diǎn)增加(17/19)，這也提示我們還要進(jìn)一步對甲型H3N2流感病毒流行株與疫苗株的抗體進(jìn)行有效的評價。

本研究發(fā)現(xiàn)，2019—2020年山東省甲型H3N2流感流行株與疫苗株在抗原表位、受體結(jié)合位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)等存在差異，提示2019—2020年山東省H3N2亞型流感病毒抗原性可能發(fā)生了轉(zhuǎn)變，同時WHO推薦的2019—2020年北半球疫苗株保護(hù)性可能不太理想。本研究從分子水平提高了流感監(jiān)測的敏感性，及時對山東省甲型H3N2流感病毒HA基因的變異情況進(jìn)行監(jiān)測，可為疫苗株的篩選提供參考，同時也為今后山東省的流感防控和分子生物學(xué)監(jiān)測提供依據(jù)。