狂犬病疫苗接種人群中狂犬病病毒中和抗體水平分析

張 磊，張 玲，張?zhí)煜?，蘇克文，談思維，邵 吉，葉海朋，曹承建，黃春萍

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RABV)引起的一種人獸共患傳染病，是目前世界上病死率最高的傳染病，一旦發(fā)病，病死率幾乎100%[1]。全世界99%的人間狂犬病發(fā)生在發(fā)展中國家，而我國狂犬病發(fā)病僅次于印度[2]。近些年，我國因狂犬病死亡人數(shù)一直高居傳染病死亡數(shù)前3位，防控形勢嚴(yán)峻[3-6]，而及時、規(guī)范的暴露后預(yù)防(post exposure prophylaxis，PEP)處置是預(yù)防狂犬病發(fā)生的唯一有效手段[7-8]，PEP內(nèi)容包括：盡早傷口處理；盡早接種狂犬病疫苗；必要時，盡早使用狂犬病被動免疫制劑[9]。由此可見，注射人用狂犬病疫苗是暴露后處置的重要環(huán)節(jié)，通過人體主動免疫產(chǎn)生病毒中和抗體以達(dá)到清除和消滅病毒的目的。WHO認(rèn)為免疫后血清中的RABV中和抗體≥0.5 IU/mL即達(dá)到有效保護(hù)水平[1]。為了解注射人用狂犬病疫苗后影響中和抗體水平的流行因素，本研究通過分析狂犬病疫苗接種人群中RABV中和抗體特征，以期為狂犬病防控提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2019-2020年杭州市職業(yè)病防治院犬傷后暴露預(yù)防接種門診進(jìn)行RABV中和抗體檢測的就診者信息，包括一般人口學(xué)基本信息、致傷動物、致傷部位、暴露等級、既往免疫史、疫苗品牌、接種程序、是否注射免疫球蛋白、是否全程接種、接種機(jī)構(gòu)、末次接種日期、檢測日期、檢測結(jié)果等。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)如下：1)全程接種狂犬病疫苗者；2)接種前未注射免疫球蛋白者；3)末次接種疫苗后至檢測中和抗體時間在半年以內(nèi)者，最終納入157例中和抗體檢測者為研究對象。

1.2 方法 采用橫斷面研究方法對RABV中和抗體水平進(jìn)行人群特征分析。全程接種狂犬病疫苗者根據(jù)其既往接種史，分為初種和復(fù)種，初種定義為除本次全程接種狂犬病疫苗外，既往無狂犬病疫苗接種史；復(fù)種定義為既往有狂犬病疫苗接種史，本次致傷距離末次接種時間超過3年而再次全程接種狂犬病疫苗者。根據(jù)《狂犬病預(yù)防控制技術(shù)指南(2016版)》[7]定義狂犬病暴露(以下簡稱暴露)：是指被狂犬、疑似狂犬或者不能確定是否患有狂犬病的宿主動物咬傷、抓傷、舔舐黏膜或者破損皮膚處，或者開放性傷口、黏膜直接接觸可能含有RABV的唾液或者組織。RABV中和抗體檢測采用快速熒光灶抑制試驗(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)：采集患者血樣5 mL，3 000 r/min離心5 min，取待測血清56 ℃水浴30 min。96孔板每孔加入100 μL加入培養(yǎng)液。加入50 μL 80%細(xì)胞感染量stock-3，同時設(shè)置病毒對照和細(xì)胞對照，37 ℃中和1 h。加入10×106個/mL BSR細(xì)胞懸液50 μL，培養(yǎng)24 h，常規(guī)熒光抗體檢測。實驗所用BSR細(xì)胞株和狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株(CVS-11)來源于中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所狂犬病室，狂犬病病毒免疫球蛋白國際標(biāo)準(zhǔn)品購自歐洲藥品質(zhì)量管理局(批號：H1100000)。

1.3 統(tǒng)計分析 為使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，將抗體效價作正態(tài)化處理，即對抗體效價進(jìn)行常用對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同特征抗體水平比較分別采用兩組比較的t檢驗和多組比較的方差分析。中和抗體水平隨時間的變化趨勢采用線性回歸方程。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 全程接種狂犬病疫苗者中和抗體水平人群特征分析 研究對象中初種者98人，復(fù)種者59人，平均年齡(30.31±13.37)歲，最小2歲，最大73歲，其余特征見表1。不同人群特征中和抗體水平比較顯示，復(fù)種者中2-1-1程序比5針法產(chǎn)生的抗體水平更高，其余特征在初種者與復(fù)種者中均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。研究對象中，僅1例初種者全程注射狂犬病疫苗后，中和抗體效價低于0.5 IU/mL，其余檢測者中和抗體效價均高于0.5 IU/mL，該例情況如下：江蘇籍3歲女童，于2020年4月7日被家養(yǎng)犬咬傷手臂，暴露等級Ⅱ級，致傷當(dāng)日在安徽宿州某村衛(wèi)生院采用5針法注射人用狂犬病疫苗，疫苗品牌不詳，2020年5月6日完成第5針接種，于2020年5月20日前往杭州市職業(yè)病防治院進(jìn)行RABV中和抗體檢測，檢測結(jié)果RABV中和抗體效價<0.5 IU/mL，該患者既往無狂犬病疫苗接種史。

表1 初種和復(fù)種狂犬病疫苗者中和抗體水平人群特征Tab.1 Crowd characteristics of rabies virus neutralizing antibody levels among primary and revaccination inoculators

圖1 RABV中和抗體水平隨時間變化趨勢Fig.1 Time trends of rabies virus neutralizing antibody levels

其中，為中和抗體效價對數(shù)值的估計值，常數(shù)項1.567(t=26.962，P<0.001)，X為末次接種狂犬病疫苗后距離檢測抗體的間隔天數(shù)，其標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為-0.322(t=-2.230，P=0.031)。根據(jù)該回歸方程可推算出末次接種疫苗后1年(即365 d)、2年(即730 d)及3年(即1 095 d)，RABV中和抗體效價95%個體區(qū)間分別為2.635～55.294 IU/mL、0.426～36.653 IU/mL和0.058～28.787 IU/mL。

3 討 論

患者接種狂犬病疫苗后，其免疫效果如何，需要通過檢測人體血清中RABV中和抗體來評價，而WHO僅推薦小鼠腦內(nèi)中和試驗(mouse neutralization test，MNT)和快速熒光灶抑制試驗(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)2種方法，作為RABV中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[10]。RFFIT因其不需要使用小鼠，且時間短(耗時2 d)等優(yōu)點較MNT的應(yīng)用更加廣泛，該方法也是我國現(xiàn)行藥典規(guī)定的檢測RABV中和抗體標(biāo)準(zhǔn)方法之一[3]。但是由于RFFIT對實驗室設(shè)備和人員要求比較高，目前國內(nèi)開展RFFIT檢測的機(jī)構(gòu)較少[11-12]，而基于此法的RABV中和抗體相關(guān)流行因素研究更是鮮見。杭州市職業(yè)病防治院在中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所狂犬病室的技術(shù)指導(dǎo)下，經(jīng)過前期充分籌備，于2019年正式開展了RABV中和抗體RFFIT臨床檢測項目。本研究通過對2019-2020年該項目檢測者的RABV中和抗體水平人群特征分析，以期對影響RABV中和抗體水平的流行因素進(jìn)行探索，為狂犬病防控提供科學(xué)參考。

本研究采用RFFIT定量檢測RABV中和抗體的基礎(chǔ)上，獲得狂犬病疫苗復(fù)種者采用2-1-1程序比5針法產(chǎn)生的抗體水平更高，提示2-1-1程序?qū)θ梭w再次免疫應(yīng)答的效果優(yōu)于5針法，這一結(jié)論與國內(nèi)學(xué)者采用雙抗夾心法和ELISA法定性檢測RABV IgG抗體，觀察到2-1-1免疫程序在接種7 d后RABV IgG抗體陽性率高于5針法的研究結(jié)論類似[13]。本研究還顯示，在初種者中不同接種程序產(chǎn)生的中和抗體水平并無統(tǒng)計學(xué)差異，除此之外，不同性別、年齡、常住地、致傷動物、動物類別、暴露等級、致傷部位、疫苗品牌、接種機(jī)構(gòu)等因素，均對初種者和復(fù)種者的RABV中和抗體水平不產(chǎn)生影響，與馮盧等[14]采用ELISA法定性檢測RABV IgG抗體，比較抗體陽性率得到年齡和暴露部位對狂犬病疫苗接種后免疫效果產(chǎn)生影響的結(jié)論不一致，其原因可能為：1)兩項研究檢測的RABV抗體類型不同；2)研究效果指標(biāo)不同，中和抗體效價為定量指標(biāo)，IgG抗體陽性率為定性指標(biāo)；3)樣本量相差較大。關(guān)于上述因素對RABV中和抗體水平的影響，尚有待進(jìn)一步積累更多樣本后深入分析。

研究還發(fā)現(xiàn)，自末次接種疫苗后RABV中和抗體效價隨時間延長呈下降趨勢，估算出末次接種疫苗后2年，RABV中和抗體效價95%個體區(qū)間為0.426～36.653 IU/mL，下限值0.426 IU/mL 低于WHO提出的有效保護(hù)水平臨界值0. 5 IU/mL[1]，提示接種疫苗2年后部分個體會出現(xiàn)失保護(hù)狀態(tài)，鑒于狂犬病的病死率幾乎100%，此時如果個體再次暴露有必要全程接種狂犬病疫苗，這一結(jié)論比我國現(xiàn)行《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范(2009版)》[15]要求的再次暴露后超過3年者應(yīng)當(dāng)全程接種疫苗的時限提前了1年。

感謝中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所狂犬病室的技術(shù)指導(dǎo)！