濟(jì)南市腹瀉患者沙門氏菌PFGE分子分型及耐藥特征研究

李 娜，劉 輝，李 健，劉 銘，姜慧鈺，陳 瀟，關(guān)恒云，劉嵐錚，張京云

沙門氏菌是能引起感染者腹瀉的重要人獸共患病原菌之一，也是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原體之一，其分布廣泛且血清型眾多[1]，然而，不同血清型的沙門氏菌的致病性和對(duì)抗生素的敏感性不同，因而沙門氏菌的血清分型以及耐藥分析對(duì)于臨床治療和研究具有重大意義[2]。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是一種研究菌株同源性的有效方法，是國(guó)際公認(rèn)的追蹤溯源的金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于細(xì)菌性傳染病的監(jiān)測(cè)及細(xì)菌性傳染病疫情暴發(fā)的病原識(shí)別、追蹤溯源有著非常重要的意義[3]。

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致了許多耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)了多重耐藥細(xì)菌或者全耐藥超級(jí)細(xì)菌，沙門氏菌作為重要的致病菌，其耐藥性不容忽視[4-5]。本研究以濟(jì)南市各哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉門診患者中分離到的沙門氏菌為研究對(duì)象，進(jìn)行PFGE分子分型和藥敏試驗(yàn)，為控制沙門氏菌在濟(jì)南地區(qū)的傳播和進(jìn)行臨床治療提供相關(guān)理論依據(jù)，同時(shí)為實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)、鑒定溯源及防控預(yù)警提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 本實(shí)驗(yàn)中90株沙門氏菌均分離自濟(jì)南市哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉門診患者的糞便標(biāo)本。脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門氏菌H9812，取自山東省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌所。藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株ATCC25922購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基和儀器試劑 沙門氏菌顯色平板購(gòu)自CHROMagar；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，XLD瓊脂均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購(gòu)自丹麥國(guó)家食品研究所；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡、VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)以及比濁儀(bioMerieus Vitek colorimeter)均購(gòu)自梅里埃生物有限公司；A3A4藥敏板購(gòu)自上海星佰生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白酶K購(gòu)自MERCK公司；Gelred購(gòu)自Biotium公司；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀購(gòu)自BIO-RID公司。

1.2 方 法

1.2.1 沙門氏菌的血清學(xué)分型 根據(jù)沙門氏菌血清型屬White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法對(duì)90株沙門氏菌進(jìn)行O抗原和H抗原血清凝集試驗(yàn)確定菌株的血清型別。

1.2.2 PFGE分子分型 參照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心Pulse Net PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行[2]，將90株分離的沙門菌株用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)，膠塊經(jīng)Gelred染液染色后成像，再將脈沖場(chǎng)電泳圖譜導(dǎo)入BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹，分析菌株間的相似性。

1.2.3 藥物敏感試驗(yàn) 利用微量肉湯稀釋法定量測(cè)定90株沙門氏菌對(duì)以下14種抗生素的藥物敏感性：環(huán)丙沙星(CIP)、氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)、氯霉素(CHL)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢他啶(CAZ)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、磺胺異噁唑(Sul)、頭孢吡肟(FEP)、左氧氟沙星(LEV)、多西環(huán)素(DOX)、鏈霉素(STR)、亞胺培南(IMI)。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)獲得相應(yīng)敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結(jié)果[2]。

2 結(jié) 果

2.1 沙門氏菌血清分型 對(duì)90株沙門氏菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定，共鑒定出27個(gè)血清型，主要為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，分別為43株和16株。

表1(續(xù))血清型抗原式菌株數(shù)占比/%姆班達(dá)卡沙門氏菌6,7:z10:e,n,z1511.11斯坦利沙門氏菌4,5,12:d:1,211.11奧拉寧堡沙門氏菌6,7:m,t:-11.11雛生化沙門氏菌9,12:-:-11.11特西翁闊沙門氏菌6,8:e,h:e,n,z1511.11門登沙門氏菌6,7:z10:1,222.22科羅拉多沙門氏菌6,7:l,w:1,511.11金斯敦沙門氏菌4,12:g,s,t:-11.11丘古沙門氏菌6,7:z10:e,n,x11.11福爾斯布特爾沙門氏菌3,10:l,v:z611.11

2.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳及聚類分析 將90株分離的沙門菌株用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)，膠塊經(jīng)Gelred染液染色后成像，90株沙門氏菌帶型相似度在49%～100%(圖1)。同一血清型沙門氏菌大部分菌株P(guān)FGE圖譜可聚集成簇，但腸炎沙門氏菌與都柏林沙門氏菌PFGE圖譜相似度較高，2種血清型菌株部分聚集成簇存在(圖1)。

圖1 90株沙門氏菌PFGE聚類分析圖譜Fig.1 PFGE analysis of 90 Salmonella isolates

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 通過肉湯稀釋法隨機(jī)抽取40株沙門氏菌做藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示其對(duì)氨芐西林耐藥率最高，其次是萘啶酸、磺胺異噁唑、四環(huán)素、多西環(huán)素和鏈霉素，對(duì)頭孢類抗生素較為敏感，對(duì)亞胺培南最敏感，敏感率為100%(表2)。

表2 40株沙門氏菌對(duì)14種抗生素的耐藥情況Tab.2 Resistance of 40 Salmonella isolates to 14 antibiotics

40株沙門氏菌中只有8株對(duì)14種抗生素完全敏感，其余32株菌都有不同程度耐藥(表3)。

表3 40株沙門氏菌耐藥譜Tab.3 Drug-resistance spectrum of 40 strains of Salmonella

3 討 論

感染性腹瀉一直是重要的公共衛(wèi)生問題，也是發(fā)展中國(guó)家常見的一種傳染病[6-7]，每年約有6億人發(fā)病，其中沙門氏菌是引起感染性性腹瀉最常見的致病菌[7]，也是濟(jì)南地區(qū)引起食物中毒的主要病原菌之一，沙門氏菌菌型繁多，迄今已發(fā)現(xiàn)2 500多個(gè)血清型[8]。本次研究中濟(jì)南市共鑒定出27個(gè)血清型，主要優(yōu)勢(shì)血清型別為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，這與國(guó)際及國(guó)內(nèi)其他研究結(jié)果一致[1-2,7,9-11]，特別是鼠傷寒沙門氏菌[12]，已成為濟(jì)南地區(qū)最常見的血清型；不同的是濟(jì)南地區(qū)的沙門氏菌血清型更復(fù)雜多樣，且近年來頻繁發(fā)生一些由罕見血清型引起的腹瀉病例或者食物中毒事件[13]；且不同血清型沙門氏菌的致病性、臨床表現(xiàn)以及流行病學(xué)特征值得我們進(jìn)一步深入研究。

沙門菌污染食品致腹瀉暴發(fā)由以前的點(diǎn)源性集中暴發(fā)，越來越多地轉(zhuǎn)變?yōu)榭绲貐^(qū)跨州(省)的散在暴發(fā)形式出現(xiàn)，使污染源及傳播途徑的發(fā)現(xiàn)存在一定難度[14]。目前，單純的沙門氏菌血清分型鑒定已經(jīng)滿足不了復(fù)雜的食源性疾病診斷及對(duì)病原體進(jìn)行溯源分析的需求，脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來一種非常有效的分子分型的方法，被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[15-17]。本研究中的PFGE分子分型結(jié)果顯示，濟(jì)南地區(qū)沙門氏菌帶型多樣具有多態(tài)性，以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的帶型最為集中，且無地域和時(shí)間的聚集性，說明近年來濟(jì)南市無沙門氏菌既往暴發(fā)，但由于分離菌株數(shù)量較少，尚需不斷擴(kuò)大監(jiān)測(cè)范圍，不斷建立并完善沙門氏菌PFGE分型數(shù)據(jù)庫(kù)，為下一步為實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)、鑒定溯源及防控預(yù)警提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致了許多耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生[18]，甚至出現(xiàn)了多重耐藥細(xì)菌或者全耐藥超級(jí)細(xì)菌，從而使越來越多的患者對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥[12,19-21]。感染患者的高病死率和缺乏有效抗感染藥物的現(xiàn)狀對(duì)臨床治療提出了挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果顯示只有20%的菌株對(duì)14種抗生素完全敏感，其余80%的菌株都有不同程度的耐藥，對(duì)氨芐西林耐藥率高達(dá)72.55%，其次是萘啶酸、磺胺異噁唑、四環(huán)素、多西環(huán)素和鏈霉素，耐藥率分別為65%、60%、55%、47.50%和55%。另外，沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象非常明顯，多重耐藥率達(dá)67.50%，與聊城地區(qū)、上海地區(qū)及云南省等多地區(qū)多重耐藥率相差不大[2,4,7,9,12,14]，但濟(jì)南地區(qū)的多重耐藥程度卻是最嚴(yán)重的，從耐藥譜來看40株菌共產(chǎn)生21個(gè)耐藥譜，優(yōu)勢(shì)耐藥譜為AMP+TET+NAL+Sul+DOX+STR，藥物種類達(dá)到6種，相對(duì)其他省市來看，濟(jì)南市耐藥形式更為嚴(yán)重，其中耐4種及以上抗生素的有25株，占62.50%(表3)，約半數(shù)菌株對(duì)6種及以上抗生素產(chǎn)生耐藥，2株鼠傷寒沙門氏菌和1株病牛沙門氏菌對(duì)9種抗生素產(chǎn)生耐藥，還有1株印第安納沙門氏菌對(duì)13種抗生素耐藥，這是在國(guó)內(nèi)沙門氏菌研究中非常罕見的，這些提示濟(jì)南市沙門氏菌的耐藥形勢(shì)非常嚴(yán)峻，對(duì)耐藥結(jié)果應(yīng)進(jìn)行深入的流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)研究，以了解沙門氏菌菌株多重耐藥原因，為解決沙門氏菌的耐藥問題提供科學(xué)依據(jù)。

總之，本研究初步建立了濟(jì)南市腹瀉人群腸道沙門氏菌PFGE分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)，為今后的流行病學(xué)溯源及防控預(yù)警奠定了基礎(chǔ)。與此同時(shí)，濟(jì)南地區(qū)沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象不容忽視，且不同血清型的沙門氏菌耐藥譜不同，臨床應(yīng)合理規(guī)范使用抗生素并加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)。另外，疾控部門、醫(yī)院和食藥監(jiān)部門應(yīng)加強(qiáng)合作，加大對(duì)食品的檢測(cè)力度及并規(guī)范抗生素的合理使用，為食源性疾病的防治提供堅(jiān)強(qiáng)后盾。