基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)菌種鑒定的臨床研究

杜巖青，秦中華，張麗霞

不同種分枝桿菌感染疾病的臨床癥狀、影像學(xué)特征十分相似，但在致病性、藥物敏感性、治療方案上常截然不同，若無準(zhǔn)確的病原學(xué)證據(jù)，可能造成誤診,因此快速、準(zhǔn)確到種甚至亞種的病原學(xué)鑒定對于分枝桿菌的確診及治療具有重要意義。

當(dāng)前國內(nèi)外實驗室主要采用液體、固體2種方法進行分枝桿菌的培養(yǎng)，固體培養(yǎng)既為傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法耗時較長，需4～6周。液體培養(yǎng)系統(tǒng)使用的自動化培養(yǎng)系統(tǒng)如BactecTMMGITTM960(BD Diagnostics, Sparks,Maryland,USA)，1～3周即可檢測到分枝桿菌的生長，較傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)更為敏感和快速，但無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，仍需進一步進行鑒定。

對于分枝桿菌的診斷，傳統(tǒng)的生化鑒定方法操作復(fù)雜，影響因素多，耗時長，結(jié)果不準(zhǔn)確，目前已不常使用，分子診斷技術(shù)的方法主要是比較同源基因或序列差異的方法[1]，由于方法復(fù)雜和成本高在臨床上較難常規(guī)開展。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF MS) 作為興起的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于臨床常見細菌的鑒定，其鑒定原理是對微生物的核糖體蛋白組分析，從而形成不同的指紋圖譜，區(qū)分微生物。核糖體蛋白提取的質(zhì)量直接影響質(zhì)譜鑒定結(jié)果，由于分枝桿菌細胞壁堅韌、脂質(zhì)含量高，不易裂解獲得足量蛋白質(zhì)，因此標(biāo)本需要前處理以獲得足量的蛋白質(zhì)，然而不同的前處理方法會影響到本方法的鑒別能力[2]。應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測分枝桿菌鑒定國內(nèi)外雖有相關(guān)研究報道，但前處理方法多局限固體培養(yǎng)培養(yǎng)[3-4]。現(xiàn)有的液體萃取方法并未獲得高的鑒定率，且步驟繁雜，需要多次處理[5]。此外，由于樣本以及液體介質(zhì)的潛在干擾，陽性菌量數(shù)較低等因素，從液體培養(yǎng)基中準(zhǔn)確的鑒定分枝桿菌還是較為困難[6]

本研究旨在通過摸索不同培養(yǎng)時間、處理方法尋找對BACTEC-960液體陽性培養(yǎng)物直接進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定的“最優(yōu)處理方法”，并通過臨床株進行驗證，所有臨床株同時做基因芯片法菌種鑒定做參照進行比對，結(jié)果不一致的通過基因測序驗證，評價分枝桿菌液體培養(yǎng)后 MALDI-TOF MS直接鑒定的臨床應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究收集天津市海河醫(yī)院2019年1月到2019年12月，MGIT 960分枝桿菌快速液體培養(yǎng)儀機器報陽的陽性培養(yǎng)物，其中420例作為研究對象。

1.2 試劑和儀器 甲酸、乙腈、基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)溶劑(美國Bruker Dahonies公司)，MALDI．TOF靶板和Autoflex MALDI．TOF質(zhì)譜儀(美國Bruker Dahonies公司)，F(xiàn)lexcontrol 3．0軟件和Biotyper 3．0軟件(美國Bruker Dahonics公司),MALDI Sepsityper Kit(美國Bruker Dahonics公司)，超聲震蕩儀，0.5 mm氧化鋯珠(美國BioSpec公司)，L-J 固體培養(yǎng)基(中國BASO 公司)，金屬浴、質(zhì)譜級純水、無水乙醇，PCR擴增儀、芯片雜交儀和芯片洗干儀(博奧生物有限公司)，微型高速離心機(Eppendorf, 5424)，分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(博奧生物有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 確定最優(yōu)前處理方法 選擇臨床上萋-尼氏染色陽性的痰標(biāo)本15份，每份標(biāo)本同時接種4支BD液體培基，進行BactecTMMGITTM960液體培養(yǎng)，4支樣本分別于“報陽”時，孵育第1 d、第2 d、第3 d，由機器取出(或第1 d報告陽性后置于37 ℃溫箱，到計劃時間取出)，革蘭染色確認(rèn)有無雜菌進行質(zhì)譜鑒定，具體操作如下：將BactecTMMGITTM960分枝桿菌快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)報陽的標(biāo)本，利用細菌超聲分散計數(shù)儀將分枝桿菌菌分散均勻記錄原管濁度，取1.2 mL培養(yǎng)液到1.5 mL Eppendorf管(孵育1、2、3 d的原管，同樣操作)；離心2 min，轉(zhuǎn)速13 000 r/min，用移液槍小心吸棄上清液；加入300 μL 去離子水，置100 ℃金屬浴30 min；樣本冷卻后，加入900 μL 75%乙醇，充分混勻；離心2 min，轉(zhuǎn)速13 000 r/min，用移液槍小心吸棄上清液；沉淀中加入約10 μL的0.1/0.5 mm 氧化鋯珠，視沉淀多少加入15～30 μL的純乙腈(沒過沉淀)，漩渦震蕩2 min或超聲破碎2 min；加入與乙腈體積相同的70%甲酸溶液，渦旋震蕩30 s；13 000 r/min 離心2 min，取上清1 μL 滴加到質(zhì)譜儀靶板上，并在室溫下自然晾干;在上述樣品點上覆蓋1 μL HCCA 基質(zhì)溶液，自然晾干后即可上機質(zhì)譜鑒定。

1.3.2 實驗階段 將420例研究樣本通過預(yù)實驗確定的“最優(yōu)處理方法”后應(yīng)用MALDI-TOF MS進行鑒定，同時應(yīng)用DNA微陣列芯片法進行分枝桿菌菌種鑒定。2種鑒定結(jié)果不一致的樣本，委托第三方實驗室以基因測序的方法進行確認(rèn)?；驕y序委托天津金唯智生物科技有限公司檢測。

2 結(jié) 果

2.1 最優(yōu)前處理方法試驗結(jié)果 對孵育不同時間的15例實驗樣本分別應(yīng)用0.1 mm、0.5 mm氧化鋯珠、漩渦震蕩/超聲破碎方式進行處理后，進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果如下：BactecTMMGITTM960系統(tǒng)報陽后，對培養(yǎng)物即刻進行MALDI-TOF-MS鑒定。BactecTMMGITTM960系統(tǒng)報陽后，對培養(yǎng)物繼續(xù)孵育1 d、2 d、3 d后，15例標(biāo)本全部鑒定出來，只是鑒定分值的不同，詳見表1。不同處理方式對比結(jié)果，經(jīng)孵育3 d，使用0.5 mm的氧化鋯珠，超聲震蕩2 min處理后的平均鑒定分值最高，為“最優(yōu)前處理方法”。

表1 不同前處理方法的MALDI-TOF-MS鑒定分?jǐn)?shù)Tab.1 MALDI-TOF-MS identification scores of different pretreatment methods

2.2 臨床標(biāo)本鑒定出的分枝桿菌質(zhì)譜結(jié)果及其質(zhì)譜圖 420例陽性標(biāo)本分別為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群290例(69.05%)、偶發(fā)分枝桿菌10例(2.38%)、膿腫分枝桿菌28例(6.67%)、胞內(nèi)分枝桿菌28例(6.67%)、堪薩斯分枝桿菌15例(3.57%)、戈登分枝桿菌4例(0.95%)、龜分枝桿菌6例(1.43%)、蘇爾加分枝桿菌1例(0.24%)、淺黃分枝桿菌9例(2.14%)、馬賽分枝桿菌2例(0.48%)、鳥分枝桿菌17例(4.05%)、摩納哥分枝桿菌2例(0.48%)、免疫分枝桿菌1例(0.24%)、荷斯坦分枝桿菌1例(0.24%)、類戈登分枝桿菌1例(0.24%)、緩黃分枝桿菌1例(0.24%)，譜圖舉例見圖1。

圖1 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析圖譜

2.3 MALDI-TOF MS和基因芯片的鑒定結(jié)果比對，見表2。

表2 MALDI-TOF MS和基因芯片的鑒定結(jié)果比對Tab.2 Comparison of identification results of MALDI-TOF MS and gene chip

2.4 MALDI-TOF MS與基因芯片鑒定成本和鑒定時間的比較 同時采用MALDI-TOF MS與基因芯片對病原菌進行鑒定，記錄2種方法所需要的鑒定時間和鑒定成本，見表3。 MALDI-TOF MS的鑒定時間及鑒定成本均明顯少于基因芯片。對臨床而言，MALDI-TOF MS性價比更高。

表3 MALDI-TOF MS 和基因芯片鑒定成本和耗時比較Tab.3 Comparison of identification cost and time between MALDI-TOF MS and gene chip

3 討 論

應(yīng)用MALDI-TOF MS直接鑒定BactecTMMGITTM960液體培養(yǎng)出的陽性培養(yǎng)物，筆者認(rèn)為主要有以下難點：①從液體培基中如何獲得足以進行鑒定的菌量；②如何去除液體培基成分對菌體蛋白的影響；③如何高質(zhì)量的獲得菌體的核糖體蛋白。

BactecTMMGITTM960自動液體培養(yǎng)檢測系統(tǒng)靈敏度設(shè)置的理念是盡可能快地檢測分枝桿菌的生長，因此，系統(tǒng)報陽時液體樣品含有較少的菌量[7]，本研究結(jié)果顯示將液體培養(yǎng)的陽性培養(yǎng)物繼續(xù)孵育至少1 d，菌量濃度≥0.5麥?zhǔn)蠁挝粫r，可獲得可鑒定出的菌量。MGITTM960 液體培養(yǎng)基的主要成分是熒光指示劑(固定在管底)和培養(yǎng)液，培養(yǎng)液包括5.9 g/L改進的肉湯培養(yǎng)基和1.25 g/L的酪蛋白胨，如直接將報陽的液體培養(yǎng)基進行加熱滅活，培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分可能會干擾菌體蛋白的提取，因此我們通過將報陽的液體培基轉(zhuǎn)移部分培養(yǎng)液至離心管，經(jīng)過離心處理后取沉淀和質(zhì)譜級純水洗滌的方式來去除液體培基可能對菌體蛋白的影響。分枝桿菌細胞壁堅韌、脂質(zhì)含量高，所以要想提取分枝桿菌的核糖體蛋白必須充分破壞其細胞壁，文獻提供的方法一般是增加微型玻璃珠機械研磨及超聲震蕩等物理裂解法，以促進細胞壁堅韌的分枝桿菌屬菌體裂解。但珠子直徑大小，震蕩時間方式文獻各有不同，周昭彥等[8]通過對3種樣本前處理方法的比較。發(fā)現(xiàn)直徑0.1 mm氧化鋯/硅膠珠機械震10 min此種前處理方法獲得的質(zhì)譜圖質(zhì)量高，優(yōu)于0.1 mm珠子震蕩3 min和0.5 mm珠子震蕩1 min的方案，楊本善等[9]提供的方案是加入0.1 mm的氧化鋯/硅膠珠，超聲破碎2 min;本研究發(fā)現(xiàn)使用直徑0.5 mm的氧化鋯珠配合超聲破碎2 min為最優(yōu)的破壁方法所得結(jié)果最優(yōu)，結(jié)論與上述2位研究者結(jié)論不同。

文獻[10-12]顯示質(zhì)譜對分枝桿菌的鑒定效能差異較大，Cao Yan等[13]在2018年經(jīng)過嚴(yán)格的篩選國外19篇涉及2 593株分枝桿菌分離物應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定的準(zhǔn)確性進行了系統(tǒng)回顧和薈萃分析，利用隨機效應(yīng)模型的森林圖總結(jié)了屬和種水平鑒定的薈萃分析的總體統(tǒng)計結(jié)果，臨床分枝桿菌MALDI-TOFMS鑒定的屬級準(zhǔn)確率為85%，種級準(zhǔn)確率為71%，該研究指出MALDI-TOF MS在臨床致病分枝桿菌鑒定中的應(yīng)用至今還不太令人滿意，特別是在物種水平上，對改進的需求還是非常重要的。

國內(nèi)也對質(zhì)譜鑒定分枝桿菌的效能進行了評價，2016年楊本善等[9]自行設(shè)計的“同仁”分枝桿菌液體培養(yǎng)MALDI-TOF MS 直接鑒定法，可將分枝桿菌鑒定至種，準(zhǔn)確率高達99.05%。2018年李松等[14]應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對55株NTM的鑒定準(zhǔn)確率進行評估，鑒定到屬水平為89.1%，種水平為78.2%；2篇文獻鑒定的準(zhǔn)確率差異較大,質(zhì)譜用于分枝桿菌鑒定的實驗數(shù)據(jù)相當(dāng)有限，臨床實驗室規(guī)模使用的前景還有待評價。本研究通過預(yù)實驗確定的“最優(yōu)處理方法”對臨床株進行處理，得到了較好的鑒定結(jié)果，質(zhì)譜鑒定420份陽性標(biāo)本中鑒定出419例，其中結(jié)核分枝桿菌占69.05%(290/420)，非結(jié)核分枝桿菌占30.00%(126/420)，星型奴卡菌占0.48%(2/420)，巴西奴卡菌占0.24%(1/420)，1例未鑒定出，總鑒定率為99.76%。質(zhì)譜鑒定分值≥2.0的400例占95.23%，分值在1.7～2.0的19例占4.52%，分值<1. 7的1例占0.24%。

基因芯片又稱 DNA或cDNA 微陣列，根據(jù)載體探針與帶標(biāo)記的待測 DNA或 mRNA 雜交產(chǎn)生的信號強弱來判斷靶DNA或mRNA中與芯片相應(yīng)基因的變異或表達情況，已有分枝桿菌菌種鑒定的商品試劑盒上市，目前可以鑒定結(jié)核分枝桿菌和16種臨床常見的NTM[15]。420份陽性標(biāo)本，基因芯片法鑒定結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌占69.05%(290/420)，非結(jié)核菌占28.81% (121/420)，9例未鑒定出，未鑒定占2.14%(9/420)，錯誤鑒定占0.95%(4/420)。

質(zhì)譜和基因芯片鑒定不一致的菌株本研究采用基因測序予以確認(rèn)。質(zhì)譜鑒定分枝桿菌均全部正確鑒定至種(結(jié)核分枝桿菌鑒定至復(fù)合群水平)。2種方法鑒定不一致的菌株中，36例陽性培養(yǎng)物鑒定為龜-膿分枝桿菌復(fù)合群，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為28株膿腫分枝桿菌，6株龜分枝桿菌和2株馬賽分枝桿菌，經(jīng)基因測序與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。龜分枝桿菌和膿分枝桿菌被認(rèn)為是在快生長分枝桿菌中人類最具致病性的菌[16],最初兩者被認(rèn)為是同一物種，直到1992年，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展才將其分離成2個不同的物種[17]。雖然龜和膿腫分枝桿菌幾乎具有相同的生物化學(xué)特征，但兩者在最佳生長溫度、藥物敏感性、致病性以及它們引起的感染類型、感控等方面存在很大差異。膿腫分枝桿菌的最佳生長溫度為28 ℃～30 ℃，而龜分枝桿菌為35℃～37 ℃。在美國，膿腫分枝桿菌是引起MTN肺病的第3種常見病原菌，占快速生長NTM肺病的80%，此外還與皮膚創(chuàng)傷、術(shù)后軟組織感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等有關(guān)[18]。相比之下，龜分枝桿菌僅僅是導(dǎo)致慢性肺病的少見原因，雖在囊性纖維化患者中較常見，但更廣為人知的是引起角膜、皮膚和軟組織感染的原因[19]。感控方面，普遍的共識認(rèn)為NTM機會性感染具有環(huán)境源性，龜分枝桿菌人與人之間的傳播還沒有文獻記載，但膿腫分枝桿菌有人與人傳播的證據(jù)[20]。許多實驗室只是簡單地將分離株鑒定到龜膿腫復(fù)合群水平。這給患者帶來了風(fēng)險，因為復(fù)合群成員間的抗生素敏感性不同,比如膿腫分枝桿菌對頭孢西丁敏感，而龜分枝桿菌則對頭孢西丁耐藥，克拉霉素均可用于治療龜和膿分枝桿菌的感染，但膿腫分枝桿菌A型攜帶完整的erm基因，更易產(chǎn)生克拉霉素誘導(dǎo)耐藥[21]，因此正確的將兩者區(qū)分具有重要的臨床意義。此外，基因芯片技術(shù)將馬賽分枝桿菌鑒定為膿腫-龜復(fù)合群，馬賽分枝桿菌屬膿腫分枝桿菌復(fù)合群，但膿腫分枝桿菌亞種對阿奇霉素和克拉霉素的耐藥性不同，其更易發(fā)生克拉霉素耐藥，而馬賽分枝桿菌對這2種藥物的耐藥性無差別，這就可以解釋臨床應(yīng)用克拉霉素方案治療膿腫分枝桿菌復(fù)合群的患者，療效有異質(zhì)性的現(xiàn)象[22]。不同物種甚至其亞種在致病性、藥物敏感性、治療反應(yīng)性常常不同，因此快速、準(zhǔn)確到種甚至亞種的病原學(xué)鑒定對于分枝桿菌的確診及治療具有重要意義。

此外成品的基因芯片商品試劑盒只能鑒定17種分枝桿菌，不在其范圍內(nèi)的分枝桿菌不能得到鑒定結(jié)果，因此對質(zhì)譜技術(shù)檢測出的摩納哥分枝桿菌，免疫分枝桿菌，緩黃分枝桿菌等得出未鑒定或鑒定錯誤的結(jié)果，MALDI-TOF MS的分枝桿菌數(shù)據(jù)庫可鑒定164個種的分枝桿菌，這也提示質(zhì)譜儀對細菌的準(zhǔn)確鑒定率與數(shù)據(jù)庫的完善與否有很大關(guān)系，Couturier[23]的研究也提到儀器數(shù)據(jù)庫中生物個體單一的參考光譜有時并不能代表分離自其他實驗室的同種典型菌株。為提高MALDI-TOF MS對細菌鑒定能力準(zhǔn)確性，我們要考慮菌株來源的地域差異性、標(biāo)本來源的多樣性和分離時間的不同。自建庫時每一種菌種的特定圖譜也應(yīng)參考多個同種菌株以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并可通過自建庫的方式擴大數(shù)據(jù)庫。但MALDI-TOF MS的缺點主要表現(xiàn)為無法鑒定不能被培養(yǎng)的細菌；對混合性細菌的鑒定存在困難；本研究中有1例鑒定法分值低于1.500，系統(tǒng)提示可能為混合性細菌，因此分值較低。

質(zhì)譜鑒定分枝桿菌的準(zhǔn)確性多是與基因測序方法比對，自己設(shè)計引物或委托公司測定，均不是臨床實驗室常規(guī)應(yīng)用的項目，而本研究用于比對的是多數(shù)臨床實驗室用于分枝桿菌鑒定的成品試劑盒，對質(zhì)譜鑒定分枝桿菌的臨床推廣更有說服力。與基因芯片的鑒定方法相比，MALDI-TOF MS分析一個樣品大約需要1 min，而整個樣品完成鑒定只需要1～2 h。每個樣品的檢測費用約為5元。如果使用大量的測試樣品，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定分枝桿菌所需的樣品量小、簡單、快速、準(zhǔn)確、廉價。綜上所述，將MALDI-TOF-MS應(yīng)用于臨床微生物實驗室進行分枝桿菌的常規(guī)鑒定是可行的，具有良好的應(yīng)用前景。