不同炮制方法對(duì)黃芩活性成份含量及抗氧化作用的影響

高可新，李利霞，王小康

(焦作市中醫(yī)院 1 中藥劑科，2 藥學(xué)部，焦作 454150)

黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒和止血安胎的功效[1]。臨床應(yīng)用有生黃芩及其炮制品，如蒸黃芩、煮黃芩、姜黃芩、蜜黃芩、炒黃芩、酒黃芩和黃芩炭等，其中以酒黃芩臨床應(yīng)用較多。生黃芩清熱瀉火解毒力強(qiáng)，善于治療熱病、濕溫黃疸、濕熱瀉痢及乳癰發(fā)背等。酒黃芩入血分，酒炙能引藥上行，緩和生黃芩的寒性，增強(qiáng)清上焦肺熱的功效。

黃酮類化合物是黃芩的主要活性物質(zhì)，代表成份為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷以及漢黃芩素等。研究表明[2-3]，黃芩中黃酮類化合物具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、抗菌消炎和抗過敏作用，以及對(duì)免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等的保護(hù)作用。

本研究以黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷以及漢黃芩素含量和抗氧化作用為指標(biāo)，考察不同炮制方法對(duì)黃芩活性成份及抗氧化作用的影響，從化學(xué)和生物藥理學(xué)角度探索黃芩炮制原理?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DAD檢測器(美國Agilent公司)；UV755B型紫外-可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；FW100型萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；XS205型分析天平(Mettler Toledo公司)等。

1.2 試藥

黃芩苷(批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%)、黃芩素(批號(hào)：111595-201808，純度：97.9%)、漢黃芩素(批號(hào)：111514-201706，純度：96.8%)以及漢黃芩苷(批號(hào)：112002-201702，純度：98.5%)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

2 研究方法

2.1 黃芩的炮制

本研究所用黃芩原藥材采購于河北藺氏盛泰藥業(yè)有限公司(批號(hào)：1909051132)，經(jīng)張志儉主任鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。黃芩炮制品的制備均按《中國藥典》2020年版“0213 炮制通則”[4]自行炮制。

生黃芩：取黃芩藥材，除去雜質(zhì)，置沸水中煮10 min，取出，悶透，切薄片，干燥。

酒黃芩：取生黃芩片，每1000 g生黃芩片，加黃酒120 g拌勻，悶透，用文火炒至表面呈微黃色，取出，放涼。

2.2 活性成份的檢測

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷10.432 mg、黃芩素2.646 mg、漢黃芩苷2.715 mg、漢黃芩素2.385 mg，于10 ml棕色量瓶中，用適量甲醇溶解并定容，制得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋2、4、6、8、16倍，制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

稱取生黃芩和酒黃芩各100 g，用萬能粉碎機(jī)粉碎，過3號(hào)篩，備用。精密稱取生黃芩和酒黃芩粉末各0.3 g，分別加入40 ml 70%乙醇，回流提取2次，每次1 h，合并濾液，70%乙醇定容至100 ml，混勻。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制成供試品溶液，平行試驗(yàn)3次。

2.2.3色譜條件

Polaris C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，流速1.0 ml/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積20 μl，檢測波長275 nm。洗脫條件：0～5 min，25%B；5～15 min，25%→55%B；15～22 min，55%B；22～23 min，55%→25%B；23～30 min，25%B。

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1DPPH清除率

取生黃芩和酒黃芩的供試品溶液各1 ml，分別加入3 ml 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后，乙醇定容至10 ml，避光處反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定吸光值。以純化水作為空白對(duì)照，0.1 mg/ml抗壞血酸作為陽性對(duì)照，計(jì)算DPPH清除率。IC50表示對(duì)自由基的抑制率為50%時(shí)的試樣溶液濃度。將待測抗氧化劑配制成系列溶液，測定各濃度抗氧化劑對(duì)DPPH的清除率，在清除率20%～80%范圍內(nèi)，繪制清除率-濃度曲線，計(jì)算出清除率為50%時(shí)的濃度值，即為IC50值。

2.3.2·OH清除率

取生黃芩和酒黃芩的供試品溶液各1 ml，分別加入0.1 ml 10 mmol/L FeSO4·7 H2O、0.1 ml 10 mmol/L EDTA、0.5 ml 10 mmol/L 2-D-脫氧核糖溶液和0.9 ml 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)；混勻后，加入0.2 ml 10 mmol/L H2O2；37 ℃水浴60 min后，用1.0 ml 2.8% TCA終止反應(yīng)；加入1.0 ml 1.0%硫代巴比妥酸，沸水浴15 min；取出冷卻后，在532 nm處測定吸光值。以磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)作為空白對(duì)照，0.1 mg/ml抗壞血酸作為陽性對(duì)照，計(jì)算·OH清除率和IC50值。計(jì)算公式同“2.3.1”項(xiàng)下公式。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1線性與范圍

以各成份對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，作線性回歸方程。結(jié)果：黃芩苷y=11.72x+175.62(r2=0.9994)，線性范圍為65.20～1043.20 μg/ml；黃芩素y=17.96x-86.29(r2=0.9997)，線性范圍為16.54～264.60 μg/ml；漢黃芩苷y=17.55x+10.39(r2=0.9995)，線性范圍為16.97～271.50 μg/ml；漢黃芩素y=8.14x-42.34(r2=0.9993)，線性范圍為14.91～238.50 μg/ml。

3.1.2精密度試驗(yàn)

取酒黃芩樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積。結(jié)果：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積RSD分別為0.75%、0.80%、0.96%和0.76%，表明儀器精密度良好。

3.1.3重復(fù)性試驗(yàn)

取酒黃芩樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法依次進(jìn)樣分析，記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積。結(jié)果：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積RSD分別為1.15%、1.33%、1.30%和1.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取酒黃芩樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法立即進(jìn)樣分析，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素不同時(shí)間峰面積。結(jié)果：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積RSD分別為0.28%、0.83%、0.34%和0.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.5回收率試驗(yàn)

取酒黃芩樣品0.15 g，精密加入各適量對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣分析，根據(jù)檢測量和加入量計(jì)算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素的加樣回收率。結(jié)果見表1，表明各檢測指標(biāo)回收率良好。

表1 加樣回收率結(jié)果n=6，%

3.2 活性成份含量測定

本研究對(duì)生黃芩和酒黃芩中4種黃酮類成份進(jìn)行測定。結(jié)果：酒黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量低于生黃芩、黃芩素和漢黃芩素含量高于生黃芩(P<0.05)。見表2。

表2 生黃芩和酒黃芩的活性成份含量測定

3.3 抗氧化作用

表3 生黃芩和酒黃芩的抗氧化作用

4 討論與結(jié)論

中藥的炮制有重要意義，表現(xiàn)為去掉非藥用部位、泥沙、灰塵等雜質(zhì)；便于粉碎和制劑；矯正不良?xì)馕?；降低毒性、減少毒副作用、緩和刺激性；改變藥物性能；增加藥物療效；引藥歸經(jīng)等。黃芩為我國的大宗藥材之一，味苦性寒，瀉火力強(qiáng)，臨床應(yīng)用前常需炮制。中醫(yī)認(rèn)為“酒炙則升”，生黃芩經(jīng)酒炙后，可引藥上行，屬于“相反為制”范疇。酒黃芩可借酒的升騰之力，作用于上焦及頭面部，有利于清上焦肺熱和四肢膚表之濕熱，又因酒性大熱，可緩解黃芩苦寒之性，減少對(duì)脾陽的損傷[5]。

目前從黃芩中分離得到的成份多達(dá)40種，主要包括黃酮類、苯甲酸、多糖、氨基酸以及微量元素等。其中，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素可作為黃芩藥材及其有關(guān)制劑的質(zhì)控指標(biāo)[6]。黃芩在炮制后，化學(xué)成份會(huì)發(fā)生一定程度的變化。本研究對(duì)生黃芩和酒黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，酒黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量低于生黃芩，黃芩素和漢黃芩素含量高于生黃芩(P<0.05)。分析原因：可能與黃芩藥材中的酶類物質(zhì)及水解作用有關(guān)。生黃芩中的酶可促進(jìn)黃芩苷和漢黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素和漢黃芩素，經(jīng)過高溫滅活，可殺酶保苷，但高熱也可能會(huì)引起黃芩苷和漢黃芩苷的分解，使含量降低。黃芩素、漢黃芩素含量的升高，說明酒炙后黃芩苷和漢黃芩苷被分解為苷元，且分解作用大于殺酶保苷作用。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)在生物體中有非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用，其含量過高時(shí)可引起線粒體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷脂類、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞大分子物質(zhì)，進(jìn)而引起癌癥、心血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病等嚴(yán)重疾病的發(fā)生[7]。抗氧化劑是維持生命健康的主要物質(zhì)，可有效減慢或抑制過量自由基對(duì)機(jī)體的損傷，降低重大疾病發(fā)病率?，F(xiàn)有的抗氧化劑包括人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。人工合成抗氧化劑存在多種不良反應(yīng)，可能會(huì)對(duì)肝、脾、肺等器官造成損傷；天然抗氧化劑源自植物，相對(duì)更加安全有效，具有較強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

綜上所述，生黃芩經(jīng)酒炙后黃芩苷和漢黃芩苷含量降低，黃芩素和漢黃芩素含量升高，抗氧化作用增加。