吡蟲啉單克隆抗體的制備及其間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法的建立

謝 波，柳心梅，盧迪莎，程勇健，羅 林，肖治理

（廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

吡蟲啉（Imidacloprid，IMI），又名1-（6-氯吡啶-3-吡啶基甲基）-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，是使用最普遍的煙堿類農(nóng)藥之一［1］，主要用于防治水稻、蔬菜、棉花等作物上的刺吸式口器害蟲，如蚜蟲、葉蟬、白粉虱等［2］。吡蟲啉通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體而使害蟲麻痹，最終死亡［3－4］。已有研究表明，吡蟲啉可大量在地表水、土壤、濕地等多種環(huán)境介質(zhì)中聚集，也會富聚在食物表面［5－6］。大劑量的吡蟲啉會引起動物胸腺、胰腺、骨髓的退行性改變，長期食用含有吡蟲啉殘留的農(nóng)產(chǎn)品，還會對人體胃粘膜造成一定的損傷［7－8］。我國對吡蟲啉制定的限量標(biāo)準(zhǔn)中水果蔬菜的最大殘留限量最低為0.05 mg/kg［9］。因此，對食品中的吡蟲啉殘留加強檢測監(jiān)控顯得十分必要。

吡蟲啉的檢測方法主要有儀器法和免疫分析方法，儀器法主要包括氣相色譜法（GC）［10］、高效液相色譜法（HPLC）等［11－12］。這些方法雖然能準(zhǔn)確檢測吡蟲啉殘留，但樣品前處理和操作復(fù)雜，設(shè)備昂貴，且需要配備專業(yè)的技術(shù)人員，成本較高，不適用于大批量樣品的篩選和現(xiàn)場檢測?；诳乖贵w特異性反應(yīng)的免疫分析方法因具有靈敏度高、特異性好、方便快速等優(yōu)勢，成為研究的熱點。常用的免疫分析方法有膠體金免疫層析法［13－14］、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）［15－16］等。與其它免疫分析法相比，膠體金免疫層析法靈敏度較低，通常只能實現(xiàn)半定量檢測。ELISA法采用辣根過氧化物酶（HRP）等標(biāo)記抗原或抗體，通過酶催化底物的顯色反應(yīng)進(jìn)行定量，但常規(guī)ELISA方法采用四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫作為底物，其靈敏度有限，有時不能滿足檢測限量低的藥物的檢測要求。

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法（CLEIA）基于酶聯(lián)免疫分析的基本原理，采用具有化學(xué)發(fā)光特性的魯米諾、異魯米諾、吖啶酯等為底物，通過測定其化學(xué)發(fā)光信號的強弱間接測定目標(biāo)抗原或抗體的濃度。該方法將高特異性的免疫反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相結(jié)合，靈敏度更高，穩(wěn)定性好［17－18］。

目前基于吡蟲啉單克隆抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫分析（ic-CLEIA）方法尚未見報道。本研究在成功合成吡蟲啉半抗原的基礎(chǔ)上制備出特異性高的單克隆抗體，基于該單克隆抗體建立了ic-CLEIA 方法，可實現(xiàn)吡蟲啉殘留的快速、靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

RPMI－1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HAT 培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基、新生胎牛血清、聚乙二醇（PEG 4000）（美國Gibco 公司）；凍存液（新賽美生物科技有限公司）；鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG－HRP）（美國Sigma公司）；3-巰基丙酸、二甲基亞砜（DMSO）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、碳二亞胺（EDC）、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、N，N-二甲基甲酰胺均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；TMB 顯色液（北京索萊寶科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光底物液A 和B（魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液，湖州英創(chuàng)生物科技有限公司）；鼠源單克隆抗體亞型檢測試劑盒（美國Sigma公司）；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品、呋蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品、啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品、噻蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品、噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）；ProteinIsoTMProtein G親和層析介質(zhì)（美國Sigma公司）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

SpectraMax L 化學(xué)發(fā)光讀板器（美國Molecular Devices 公司）；NanoDrop 紫外分光光度計（美國Thermo 公司）；磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）；微量振蕩器（常州澳華有限公司）；高速離心機、微量可調(diào)移液器（i國Eppendorf公司）；電子分析天平（梅特勒公司）；96孔酶標(biāo)板、96孔白色發(fā)光板（深圳金燦華實業(yè)有限公司）；DEM－3型自動洗板機（美國Thermo公司）；Agilent（1290－6470）型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；蛋白電泳儀（SDS－PAGE，美國BIO－RAD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 半抗原的合成與鑒定 吡蟲啉半抗原的合成參考文獻(xiàn)［19］方法，合成路線如圖1所示，將吡蟲啉原藥與3-巰基丙酸通過取代反應(yīng)獲得吡蟲啉半抗原｛1-［6-（2-羧基乙硫基）-3-吡啶基甲基］-N-硝基亞咪唑烷-2-叉胺｝（IMPA），柱層析法純化后，采用質(zhì)譜法（MS－ESI）鑒定。

圖1 吡蟲啉半抗原合成路線Fig.1 Synthetic route of imidacloprid hapten

1.3.2 完全抗原的合成與鑒定 通過活潑酯法［20］將半抗原與載體蛋白KLH 和BSA 偶聯(lián)，獲得完全抗原IMPA－KLH、IMPA－BSA，其中IMPA－KLH 作為免疫原，IMPA－BSA 作為包被原。合成路線如圖2所示，采用紫外掃描法進(jìn)行鑒定［21］。

圖2 完全抗原合成路線圖Fig.2 Synthetic route of complete antigens

1.3.3 單克隆抗體的制備、純化及鑒定 取7 ～8 周齡的Balb/c 雌性小鼠，將500 μL 完全抗原IMPAKLH（1 mg/mL）與500 μL佐劑乳化，免疫5只小鼠，每只小鼠每次免疫200 μL。在小鼠腹腔、背部、皮下等進(jìn)行多點注射，每隔2 周加強免疫1 次［22］。從第3 次免疫開始，每次免疫1 周后于小鼠尾部取血，以ELISA 檢測效價，ic-ELISA 測定抑制率［23］。選取血清效果最好的小鼠獲取脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞，并在PEG4000 的作用下融合［24］，用ic-ELISA 方法篩選能特異性識別吡蟲啉藥物的陽性孔。通過有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行篩選，篩出能穩(wěn)定分泌吡蟲啉抗體的細(xì)胞株。將細(xì)胞注入小鼠腹腔以誘導(dǎo)腹水，腹水通過Protein G 柱［25］純化得到單克隆抗體，采用SDS－PAGE凝膠電泳［26］驗證純化效果，以鼠源單克隆抗體亞型試劑盒［27］鑒定抗體亞型。

1.3.4 ic-CLEIA 方法操作步驟 用包被液將包被原IMPA－BSA 稀釋至一定濃度，加至化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板孔中，每孔100 μL，37 ℃孵育過夜。洗板機洗滌2 次，甩干，每孔加入封閉液（含2%BSA 的磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST））130 μL，37℃溫育箱中溫育3 h，甩干孔中封閉液，置37 ℃烘箱中烘1 h，備用；用磷酸鹽（PBS）緩沖液將吡蟲啉稀釋至系列濃度，抗體稀釋至系列梯度，每孔分別加入不同濃度的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)液和抗體稀釋液各50 μL，輕搖混合，37 ℃恒溫箱中孵育30 min。洗板機洗滌5次，拍干，加入5 000 倍稀釋的IgG－HRP，37 ℃溫育箱中溫育30 min，洗板機洗滌5 次，甩干；加入等體積混合的化學(xué)發(fā)光A 液和B 液100 μL，立即用化學(xué)發(fā)光儀測定其相對發(fā)光值（RLU）。以吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)物藥物濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，RLU/RLUmax為縱坐標(biāo)（RLUmax表示藥物濃度為0時的發(fā)光值），應(yīng)用Origin 軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 ic-CLEIA 方法條件優(yōu)化 采用棋盤滴定法，將包被原IMPA－BSA（初始質(zhì)量濃度為1 mg/mL）進(jìn)行倍比稀釋，稀釋倍數(shù)分別為4 000、8 000、16 000、32 000、64 000；將吡蟲啉單克隆抗體（初始質(zhì)量濃度為6.6 mg/mL）進(jìn)行倍比稀釋，稀釋倍數(shù)與IMPA－BSA 相同。按照“1.3.4”步驟進(jìn)行實驗，根據(jù)RLU7/RLUmax＞0.8 且RLU1/RLUmax＜0.2 的原則［28］篩選出包被原和抗體稀釋倍數(shù)范圍，其中RLU1表示加入最大藥物濃度對應(yīng)的發(fā)光值，RLU7表示加入最小藥物濃度對應(yīng)的發(fā)光值。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行包被原和抗體最適工作濃度優(yōu)化。按照“1.3.4”步驟進(jìn)行實驗，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇IC50（半抑制濃度）較低、RLUmax/IC50較高，RLUmax適中的條件作為最佳反應(yīng)條件［29］。

在最佳包被原和抗體濃度下進(jìn)行ic-CLEIA 實驗，考察緩沖體系（PBS、PBST、Tris－HCl）、緩沖液的pH 值（5.4、6.4、7.4、8.4）、一抗反應(yīng)時間（20、30、40、50 min）、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)（4 000、5 000、6 000、7 000倍）對ic-CLEIA 方法的影響。同樣以RLUmax/IC50較高、IC50較低、RLUmax適中的條件為ic-CLEIA最佳反應(yīng)條件。

1.3.6 ic-CLEIA 特異性實驗 單克隆抗體識別吡蟲啉的特異性用交叉反應(yīng)率（CR）表示，即吡蟲啉的IC50與結(jié)構(gòu)類似物IC50比值的百分?jǐn)?shù)。對吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物的CR 越小，表明該方法的特異性越高。其計算公式如下：

1.3.7 樣品前處理 參考文獻(xiàn)［30］進(jìn)行樣品前處理：稱取約10 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉（三級水中飽和）浸泡5 min，在渦旋式振蕩器上振蕩1 min，然后超聲10 min，加入9 mL混合有機溶劑（乙腈∶二氯甲烷=16∶2，體積比）及4 mL 正己烷，振蕩1 min，超聲5 min，4 000 r/min 離心5 min，將中層液移至15 mL離心管中，樣品殘渣繼續(xù)加入6 mL乙腈－二氯甲烷（16∶2）混合溶劑，以4 mL正己烷提取2次，合并提取液。在氮吹儀中（45 ℃水?。┐蹈?，用PBS溶液復(fù)溶，放入4 ℃冰箱保存，待測。

黃瓜和蘋果樣品參考以上方法前處理后用PBS 緩沖液分別稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以稀釋后的溶液作為緩沖液，進(jìn)行ic-CLEIA實驗，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察基質(zhì)效應(yīng)消除條件。

1.3.8 加標(biāo)回收實驗 根據(jù)ic-CLEIA 方法檢測范圍，在空白樣品中添加低、中、高（5、10、20 ng/g）3個水平的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)“1.3.7”樣品前處理后獲得提取液。提取液經(jīng)ic-CLEIA 方法檢測，每個濃度重復(fù)測定3次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.9 實際樣品檢測 從周邊市場上分別購買黃瓜和蘋果樣品各5 個，經(jīng)“1.3.7”樣品前處理后分別用ic-CLEIA方法和高效液相色譜法（HPLC）［30］檢測，對比分析兩種方法的檢測結(jié)果。

HPLC 法條件如下：色譜柱為UG 120－C18柱（250 mm × 4.6 mm，0.5 μm）；柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。流動相由水（A）和乙腈溶液（B）組成，梯度洗脫條件為：0 ～15 min，5% B，15 ～17 min，30%B，17 ～20 min，10%B，20 ～30 min，5%B。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的鑒定

半抗原采用質(zhì)譜法（MS－ESI）進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。半抗原IMPA 的相對分子質(zhì)量為325，質(zhì)譜圖中m/z326.2 處有一個超強信號峰，在氫離子的正離子模式下，比設(shè)計的IMPA 相對分子質(zhì)量大1，符合預(yù)期分子量。說明IMPA成功合成。

圖3 IMPA的MS－ESI鑒定圖譜Fig.3 Identification result of IMPA by MS－ESI

2.2 完全抗原的鑒定

半抗原、載體蛋白和完全抗原具有不同的紫外特征吸收峰，當(dāng)完全抗原的吸收峰中含有半抗原、載體蛋白的特征吸收峰或其最大吸收峰相對于載體蛋白有明顯偏移時，證明完全抗原偶聯(lián)成功。如圖4 所示，完全抗原的紫外吸收峰與半抗原、載體蛋白的紫外吸收峰相比均有明顯偏移，不相互重疊，表明完全抗原偶聯(lián)成功。

圖4 吡蟲啉半抗原IMPA與完全抗原的紫外掃描圖譜Fig.4 UV spectra of imidacloprid hapten IMPA and complete antigens

2.3 單克隆抗體的制備、純化及鑒定

（1）細(xì)胞株的建立：小鼠在第4 次免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3 ～4輪有限稀釋后，最終篩選得到穩(wěn)定分泌吡蟲啉單克隆抗體的細(xì)胞一株，命名為IMPA－X。

（2）抗體的制備：將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，7 d后小鼠腹腔因誘導(dǎo)出腹水而明顯脹大，此時取出腹水并離心去掉脂肪和雜質(zhì)，4 ℃冰箱保存，備用。

（3）抗體的純化及鑒定：采用Protein G 柱純化小鼠腹水，得到吡蟲啉單克隆抗體。純化后的抗體經(jīng)紫外分光光度計測得質(zhì)量濃度為6.6 mg/mL。通過SDS－PAGE凝膠電泳驗證純化效果，其電泳圖如圖5所示。純化后的抗體在未還原的情況下只有一個條帶，約為150 kDa，即標(biāo)記為“2”的條帶；高溫還原后因抗體二硫鍵斷裂，會出現(xiàn)兩個條帶，一條為重鏈，約為50 kDa；一條為輕鏈，約為25 kDa，即標(biāo)記為“3”中的兩個條帶，表明抗體純化成功。

圖5 吡蟲啉單克隆抗體的SDS－PAGE凝膠電泳圖Fig.5 SDS－PAGE electropherogram of imidacloprid monoclonal antibody

2.4 ic-CLEIA條件的優(yōu)化

2.4.1 包被原、抗體最適工作濃度的確定 根據(jù)RLU7/RLUmax＞0.8 且RLU1/RLUmax＜0.2 的原則，結(jié)合棋盤法的測定結(jié)果，確定包被原和抗體的稀釋倍數(shù)均在1∶4 000 ～1∶64 000之間。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)行包被原和抗體最適工作濃度優(yōu)化。按照“1.3.4”的步驟進(jìn)行ic-CLEIA 實驗。結(jié)果表明，當(dāng)包被原稀釋倍數(shù)為1∶16 000，抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000 時，其IC50較低，RLUmax/IC50較高，此時包被原和抗體的工作質(zhì)量濃度分別為62.50 ng/mL和103.12 ng/mL。

2.4.2 最佳緩沖溶液、緩沖溶液pH 值、一抗反應(yīng)時間及酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 依據(jù)RLUmax、IC50和RLUmax/IC503 個指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)緩沖溶液為0.01 mol/L 的PBS，緩沖溶液的最佳pH 值為7.4，最佳一抗反應(yīng)時間為30 min，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1∶7 000。

2.4.3 ic-CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線 優(yōu)化后的最佳條件為：包被原質(zhì)量濃度62.50 ng/mL，抗體質(zhì)量濃度103.12 ng/mL，緩沖液PBS（pH 7.4），一抗競爭反應(yīng)時間30 min，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)1∶7 000。根據(jù)ic-CLEIA 優(yōu)化條件進(jìn)行實驗并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖6 所示。該方法線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.083 ～3.99 ng/mL，IC50為0.57 ng/mL，檢出限IC10為0.03 ng/mL。

圖6 檢測吡蟲啉的ic-CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of ic-CLEIA method for imidacloprid detection

2.5 ic-CLEIA特異性分析

選擇氯噻啉、噻蟲胺、呋蟲胺、啶蟲脒、噻蟲啉、噻蟲嗪6 種吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物，用ic-CLEIA 測定其IC50，以驗證該方法的特異性。結(jié)果如表1 所示，方法與氯噻啉的交叉反應(yīng)率為2.2%，與噻蟲胺等5種吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物無明顯交叉反應(yīng)，表明建立的ic-CLEIA方法特異性較好。

表1 吡蟲啉ic-CLEIA方法的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross reaction rate of ic-CLEIA method on imidacloprid

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果如圖7所示，黃瓜和蘋果樣品分別稀釋20倍、10倍后建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，可認(rèn)為該條件下基質(zhì)效應(yīng)基本被消除。

圖7 基質(zhì)效應(yīng)消除曲線Fig.7 Elimination of matrix effect in real samples

2.7 加標(biāo)回收實驗

黃瓜和蘋果樣品中分別添加5、10、20 ng/g的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，樣品前處理后用ic-CLEIA方法進(jìn)行測定。結(jié)果如表2 所示，黃瓜樣品的加標(biāo)回收率為86. 0% ～102%，蘋果樣品為82. 0% ～112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。表明該方法準(zhǔn)確度較高，可用于蔬菜水果中吡蟲啉殘留的檢測。

表2 吡蟲啉ic-CLEIA方法的加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 2 Results of addition and recovery experiment of imidacloprid with ic-CLEIA method

2.8 儀器方法驗證

從周邊市場購買蘋果和黃瓜樣品各5 份，樣品前處理后分別用HPLC 和ic-CLEIA 進(jìn)行測定。以HPLC法測得的吡蟲啉濃度為X軸，ic-CLEIA法測得的吡蟲啉濃度為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析。線性方程為y=0.952x+0.195，相關(guān)系數(shù)r2為0.989。表明所建立ic-CLEIA 方法的測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于實際樣品測定。

2.9 與其他方法的比較

與表3 所列舉的文獻(xiàn)相比，本研究基于單克隆抗體建立的檢測吡蟲啉的ic-CLEIA 方法，靈敏度有所提高，具有良好的應(yīng)用前景，為開發(fā)相應(yīng)試劑盒產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

表3 與近年來部分吡蟲啉免疫分析方法的對比Table 3 Comparison with some recent literatures on imidacloprid immunoassay

3 結(jié) 論

本研究通過將吡蟲啉原藥與3-巰基丙酸反應(yīng)獲得半抗原，制備得到單克隆抗體，建立了檢測吡蟲啉的ic-CLEIA方法，方法線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.083 ～3.99 ng/mL，IC50為0.57 ng/mL，檢出限IC10為0.03 ng/mL。與氯噻啉的交叉反應(yīng)率為2.2%，與噻蟲胺等5 種吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物無明顯交叉反應(yīng)。對黃瓜和蘋果樣品的加標(biāo)回收率為82.0%～112%，且與HPLC 法的測定結(jié)果具有良好的相關(guān)性。所建立的ic-CLEIA方法特異性較強、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于實際樣品中吡蟲啉殘留的快速檢測。