疏水性低共熔溶劑液液微萃取/高效液相色譜法測(cè)定豆奶中三嗪類和苯脲類除草劑

朱 清，龍冰華，陳星航，閆 徐，朱紅年，馮 吉，徐尉力，王志兵

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

豆奶是人們常飲用的一種豆類作物制品［1］，具有口感細(xì)膩、香味濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，深受大眾喜愛。隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，培育優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物離不開除草劑的使用。三嗪類和苯脲類除草劑是農(nóng)業(yè)中兩類重要的除草劑，兩者均是通過(guò)抑制植物的光合作用而控制雜草，常被用于豆科作物田間雜草的防治［2－3］。但這兩類除草劑具有較好的穩(wěn)定性，水溶性和較高的致癌風(fēng)險(xiǎn)［4］，極易通過(guò)生物富集作用殘存于水稻［5］、小麥［6－7］和大豆［8］中，直接或間接地對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。因此，建立一種操作簡(jiǎn)單、快速高效的檢測(cè)豆奶中三嗪類和苯脲類除草劑殘留的方法尤為重要。目前，食品中三嗪類和苯脲類除草劑常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜－質(zhì)譜法［9－10］、毛細(xì)管電泳法［11］、氣相色譜法［12－13］以及高效液相色譜法［14－15］等。其中高效液相色譜法具有靈敏度高、分離效率高、分析速度快、操作簡(jiǎn)單快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，常被用于食品中農(nóng)藥殘留的分離與檢測(cè)。

由于食品基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)物含量低，在分析前通常需對(duì)樣品進(jìn)行前處理。因此，各種樣品前處理方法應(yīng)運(yùn)而生，如固相萃取法［16－17］、QuEChERS 法［18］、液液萃取法［19］、基質(zhì)固相分散法［20］和液液微萃取法［21］等。其中，液液微萃取法是在液液萃取法基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一類新型萃取方法，具有溶劑用量少、操作簡(jiǎn)單、富集效率高、成本低等特點(diǎn)［22－23］，常被用于農(nóng)殘分析檢測(cè)。然而，液液微萃取法常以有機(jī)試劑作為萃取劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境具有一定的危害性，且有些是親水性萃取劑，往往需通過(guò)旋蒸、氮吹等方式實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的富集，從而增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性和難度。

低共熔溶劑（DES）是一類由氫鍵供體和氫鍵受體依靠二者之間的氫鍵作用，按照一定化學(xué)計(jì)量比形成的兩組分或三組分低共熔混合物［24］。DES 作為一種新興的綠色溶劑，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，具有低揮發(fā)性、易合成、環(huán)境友好、易生物降解、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)［25－26］，在液液微萃取中常作為萃取溶劑用于生物［27］、食品［28］和環(huán)境［29］樣品中農(nóng)藥殘留的萃取。然而，目前常用于萃取分離領(lǐng)域的大多是親水性DES［30］，使其在含水樣品目標(biāo)物提取中的應(yīng)用受到限制。2015 年，Osch 等［31］首次開發(fā)了疏水性DES，并成功地將其用于從水溶液中回收揮發(fā)性脂肪酸。但由于不同組分、不同配比的DES 具有不同性能，且溫度對(duì)其萃取性能有一定影響，導(dǎo)致其應(yīng)用受限。

本研究以四丁基氯化銨為氫鍵受體，六氟異丙醇為氫鍵供體，通過(guò)加熱磁力攪拌的方法合成了一種新型疏水性DES，并將其作為萃取劑，通過(guò)液液微萃取法對(duì)豆奶中的4 種除草劑（阿特拉津、去草凈、滅草隆和綠麥?。┻M(jìn)行萃取，同時(shí)結(jié)合高效液相色譜（HPLC）對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行了提取條件優(yōu)化和分析方法評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1100型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）、Zorbax SB－C18色譜柱（150 mm×4.6 mm×3.5 μm）和C18預(yù)柱（7.5 mm × 2.1 mm × 5 μm）購(gòu)于美國(guó)Agilent 公司；AG 5428 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（i國(guó)Eppendorf 公司）；BT100S 型蠕動(dòng)泵（上海篤特科儀器有限公司）；XW－80A 旋渦混合器（上海米青科實(shí)業(yè)有限公司）；KQ－100DE超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

三嗪類和苯脲類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品：阿特拉津、去草凈、滅草隆和綠麥?。兌染?9.5%，阿拉丁試劑公司）；中性氧化鋁（200～300 目，pH：6.5～7.5），購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇和六氟異丙醇（色譜純，科隆化學(xué)品有限公司）；四丁基氯化銨（上海成捷化學(xué)有限公司）；其他試劑均為分析純，購(gòu)自北京化工廠。

不同品牌的市售包裝豆奶（按品牌不同編號(hào)樣品1～4），均購(gòu)于長(zhǎng)春市當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取4種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，混勻后得到500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃避光保存，備用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用工作溶液均由各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液經(jīng)乙腈稀釋得到。

1.2.2 低共熔溶劑的制備 以四丁基氯化銨為氫鍵受體，六氟異丙醇為氫鍵供體合成DES，將受體與供體分別按摩爾比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（依次記為DES－1、DES－2、DES－3、DES－4、DES－5）加至燒杯中，將燒杯置于60 ℃水浴以5 000 r/min 磁力攪拌，直至形成均勻透明的液體，DES合成完畢，冷卻后在40 ℃下密封保存。

1.2.3 樣品前處理 在課題組前期研究［32］基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，對(duì)市售包裝豆奶進(jìn)行除蛋白和凈化處理。

三氯乙酸除蛋白：取9 mL 樣品于10 mL 離心管中，加入1 mL 100 g/L 的三氯乙酸溶液，振搖1 min，將離心管以7 000 r/min離心5 min，取出全部上清液備用。

凈化：取2.00 g 中性氧化鋁置于上下墊有脫脂棉的10 mL 一次性注射器中，在蠕動(dòng)泵的輔助下（10 mL/min）對(duì)上述上清液進(jìn)行凈化，收集6 mL 作為凈化后樣品溶液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。除“2.2.3”實(shí)際樣品分析外，其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由樣品1（某品牌市售包裝豆奶樣品）獲得。

1.2.4 低共熔溶劑液液微萃取 萃取流程如圖1所示，首先取6 mL凈化后樣品溶液置于10 mL離心管中，向其中加入200 μL DES和0.4 g NaCl，渦旋3 min，使DES和樣液充分接觸，渦旋后DES在試管底部迅速聚集，形成兩相體系，將其在2 000 r/min條件下離心3 min，使富集目標(biāo)物的DES和樣液充分分離。取200 μL下相用100 μL乙腈回溶后，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾頭，濾液注入系統(tǒng)進(jìn)行HPLC分析。

圖1 低共熔溶劑液液微萃取流程圖Fig.1 Flow chart of liquid－liquid microextraction with deep eutectic solvents

1.2.5 色譜條件 流動(dòng)相：由水（A）和乙腈（B）組成，洗脫梯度條件為：0～20 min，50%～55% B；20～25 min，55%～60% B；25～30 min，60%～55% B；30～35 min，55% B。流動(dòng)相流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，柱溫為30 ℃，三嗪類和苯脲類除草劑的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為222 nm和245 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Excel 軟件對(duì)萃取條件優(yōu)化與方法學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)Origin 2017 軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 DES 種類的影響 液液微萃取技術(shù)中萃取溶劑必須對(duì)目標(biāo)物具有一定的溶解性?？疾炝税础?.2.2”方法合成的DES（DES－1、DES－2、DES－3、DES－4、DES－5）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。如圖2 所示，選用DES－3時(shí)各目標(biāo)物的回收率最高，即受體與供體摩爾比為1∶1 時(shí)，所制備的DES 對(duì)目標(biāo)物的萃取效果最佳。這可能是由于該摩爾比條件下，合成的DES 氫鍵作用力強(qiáng)，粘度低，流動(dòng)性大，更易分散于溶液中，進(jìn)而提高對(duì)目標(biāo)物的萃取效率。因此，本研究選用DES－3作為萃取劑。

圖2 DES種類對(duì)4種目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of DES types on recoveries of 4 analytes

2.1.2 DES 用量的影響 考察了DES 用量（100、200、300、400、500 μL）對(duì)4 種目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)DES 的用量在100～200 μL 范圍時(shí)，各目標(biāo)物回收率隨著DES 用量的增加而增大，當(dāng)DES用量為200 μL時(shí)回收率最大；繼續(xù)增加DES用量，目標(biāo)物的回收率總體呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵黾覦ES 的用量，增強(qiáng)了DES 對(duì)目標(biāo)物的溶解能力所致。而繼續(xù)加入DES，導(dǎo)致DES 粘度變大，傳質(zhì)效能降低使得目標(biāo)物殘留在水相中，影響DES 相和水相的分離，并且一部分水進(jìn)入DES 相中導(dǎo)致目標(biāo)物的濃度降低，使萃取效率下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇DES用量為200 μL。

2.1.3 NaCl 用量的影響 NaCl 的加入可增加樣液的離子強(qiáng)度，同時(shí)減少目標(biāo)物在水相中的溶解度，從而更好地被萃取劑富集，提高目標(biāo)物的回收率?？疾炝薔aCl 用量（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0 g）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，NaCl的加入可明顯提高目標(biāo)物的回收率，NaCl用量在0～0.3 g時(shí)，4種目標(biāo)物的回收率隨NaCl用量的增加呈上升趨勢(shì)；NaCl用量增至0.4 g時(shí)，除了去草凈的回收率略有下降外，其余3 種目標(biāo)物的回收率達(dá)到最大值。這主要是因?yàn)镹aCl的加入量較小時(shí)，鹽析效應(yīng)起主導(dǎo)作用，降低了目標(biāo)物在水中的溶解度，提高了目標(biāo)物回收率。但NaCl 用量繼續(xù)增加時(shí)，目標(biāo)物的回收率反而降低，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的鹽會(huì)增大樣液的粘性，抑制DES 分散，從而降低了DES和樣液間的傳質(zhì)效率。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇NaCl用量為0.4 g。

2.1.4 渦旋時(shí)間的影響 渦旋可使疏水性DES分散在水中?？疾炝藴u旋時(shí)間（0、1、2、3、4、5、6、7、8 min）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著渦旋時(shí)間的增加，目標(biāo)物的回收率顯著增加。當(dāng)渦旋時(shí)間為3 min 時(shí)，阿特拉津的回收率略有下降，其他3 種目標(biāo)物的回收率達(dá)到最大值。這是由于渦旋促使DES 分散成細(xì)小的液滴并均勻分散在水中，增大了DES 與目標(biāo)物的接觸面積，更有利于富集目標(biāo)物。但繼續(xù)增加渦旋時(shí)間，目標(biāo)物的回收率有所下降，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間劇烈渦旋導(dǎo)致DES 不易團(tuán)聚，也可能是破壞了部分DES 之間的氫鍵，導(dǎo)致萃取效果不佳。因此，為縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間和提高萃取效果，實(shí)驗(yàn)選擇渦旋時(shí)間為3 min。

2.1.5 pH 值的影響 pH 值會(huì)影響樣液中蛋白質(zhì)和目標(biāo)物的存在狀態(tài)，當(dāng)pH 值由酸性變?yōu)閴A性時(shí)，樣品溶液由無(wú)色變?yōu)辄S綠色，部分酸性蛋白達(dá)到等電點(diǎn)而析出，對(duì)目標(biāo)物有一定的吸附作用，從而影響目標(biāo)物的回收率。實(shí)驗(yàn)考察了不同pH 值對(duì)目標(biāo)物回收率的影響（如圖3）。結(jié)果顯示，當(dāng)pH 值為6.0 時(shí)，4 種目標(biāo)物的回收率整體達(dá)到較大值；而當(dāng)pH 值為7.0 時(shí)，去草凈的回收率略有下降，其余3種目標(biāo)物的回收率均略有提高。經(jīng)過(guò)方差統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)在pH 6.0和pH 7.0 時(shí)的回收率無(wú)顯著性差異。由于樣品前處理后樣液的pH 值約為6.0，為簡(jiǎn)化操作步驟，實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為6.0。

圖3 pH值對(duì)4種目標(biāo)物回收率的影響Fig.3 Effect of pH value on recoveries of 4 analytes

2.1.6 溫度的影響 改變樣液的溫度，可能會(huì)影響各組分的溶解速度以及DES和樣液的傳質(zhì)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)考察了樣液溫度（0、15、25、30、35、40 ℃）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果表明溫度對(duì)目標(biāo)物萃取效果的影響不明顯。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，本實(shí)驗(yàn)選擇在室溫下操作。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限 配制含有4 種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈進(jìn)行等度稀釋后分別加入樣品中，制備成系列質(zhì)量濃度（1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μg/L）的加標(biāo)樣品。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按照“1.2.3”和“1.2.4”步驟對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行凈化和萃取，以加標(biāo)質(zhì)量濃度（ρ，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，各目標(biāo)物在1.00～500.00 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r≥0.998 4）。分別以11 組低濃度加標(biāo)樣品在信噪比為3 和10 時(shí)所能檢測(cè)的目標(biāo)物最低質(zhì)量濃度作為本方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），計(jì)算得到方法的LOD和LOQ分別為0.56～0.95 μg/L和1.87～3.16 μg/L（如表1）。

表1 目標(biāo)物的線性關(guān)系、檢出限和定量下限Table 1 Linear relations，LODs and LOQs for the analytes

2.2.2 精密度 分別在3 個(gè)不同加標(biāo)水平（10.00、25.00、50.00 μg/L）下測(cè)定日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以評(píng)價(jià)方法的精密度。其中，日內(nèi)RSD 通過(guò)在1 d內(nèi)平行分析6次加標(biāo)樣品得到；日間RSD通過(guò)每天分析1 次，連續(xù)測(cè)定6 d 得到。如表2 所示，日內(nèi)和日間RSD 分別為0.28%～2.0%和2.1%～7.5%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度。

表2 日內(nèi)與日間精密度（n=6）Table 2 Intra-day and inter-day precisions for the analytes（n=6）

2.2.3 加標(biāo)回收率與實(shí)際樣品分析 為了進(jìn)一步考察方法的實(shí)用性，采用本方法對(duì)4種不同品牌的市售包裝豆奶樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，樣品中均未檢出目標(biāo)物。對(duì)上述空白樣品進(jìn)行不同加標(biāo)濃度（10.00、50.00 μg/L）的回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)樣品平行測(cè)定3 次，各目標(biāo)物的回收率為86.4%～117%，RSD為0.13%～5.7%（如表3）。混合標(biāo)準(zhǔn)品和加標(biāo)樣品的液相色譜圖如圖4所示，可以看出各目標(biāo)物在保留時(shí)間內(nèi)出峰規(guī)律，無(wú)重疊，無(wú)明顯干擾峰，說(shuō)明該方法可用于豆奶中4種目標(biāo)物的分離與測(cè)定。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）和加標(biāo)樣品（B）的色譜圖Fig.4 Chromatograms of mixed standards（A）and spiked sample（B）peaks：1.atrazine，2.terbutryn，3.monuron，4.chlortoluron

表3 實(shí)際樣品的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of actual samples（n=3）

2.3 方法比較

本方法與文獻(xiàn)方法的比較如表4 所示。相較于離子液體基質(zhì)固相萃取法（MSPD－IL），本法采用DES 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)溶劑作萃取劑，具有回收率高、檢出限低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。與離子液體液液微萃取法（DLLME－IL）相比，本法具有萃取效率高、萃取劑用量少等特點(diǎn)。本研究將DES 液液微萃?。―LLME－DES）與高效液相色譜法相結(jié)合，通過(guò)渦旋、離心等輔助手段，使提取過(guò)程更簡(jiǎn)單、高效，檢出限更低。因此，相對(duì)于基質(zhì)固相萃?。∕SPD）、固相萃?。⊿PE）等方法，本方法在萃取溶劑的綠色安全性、操作的簡(jiǎn)便性以及方法高效性方面具有一定優(yōu)勢(shì)。

表4 本方法與文獻(xiàn)方法的比較Table 4 Comparison between the proposed method and other methods

3 結(jié) 論

本研究用六氟異丙醇和四丁基氯化銨按照1∶1的摩爾比合成了一種新型的疏水性低共熔溶劑，并將其作為萃取溶劑，通過(guò)液液微萃取法對(duì)不同種類市售包裝豆奶中的4 種三嗪類和苯脲類除草劑殘留進(jìn)行提取與富集，結(jié)合高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。研究表明，以新合成的低共熔溶劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑作為萃取劑，更加綠色、環(huán)保。該方法具有檢出限低、萃取時(shí)間短、成本低等特點(diǎn)，可為其他除草劑殘留的分析與檢測(cè)提供參考依據(jù)。