FSH-PI3K/AKT/NF-κB蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制

路曉琳

卵巢癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，上皮性卵巢癌5年生存率僅為30%～40%，死亡率居于婦科惡性腫瘤首位［1-2］。激素環(huán)境與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，過(guò)量卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）刺激可能是卵巢癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［3］。有文獻(xiàn)證實(shí)，F(xiàn)SH 通過(guò)作用于細(xì)胞表面FSH 受體（FSHR）促使細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路被激活，從而在卵巢癌中發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制仍有待探討［4］。研究顯示，磷脂酞肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）通路在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［5］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear transcription factor κB，NF-κB）屬于信號(hào)通路的中樞，與細(xì)胞增殖、凋亡聯(lián)系緊密［6］。因此，本研究嘗試探究FSHPI3K/AKT 信號(hào)通路-NF-κB 蛋白對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響，旨在為臨床制定治療方案提供依據(jù)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取邯鄲市中心醫(yī)院2015年7月至2016年10月手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織（32 例）、卵巢交界性腫瘤組織（32 例）、卵巢良性腫瘤組織（32例）、正常卵巢組織（32 例）作為研究資料來(lái)源，采用搔刮法對(duì)人卵巢表面上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，SKOV-3 細(xì)胞株為北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科實(shí)驗(yàn)室提供；3AO 細(xì)胞株為河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，均用常規(guī)RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；注射用重組人卵泡刺激素來(lái)自瑞士Laboratoires Serono SA 公司；LY294002 來(lái)自美國(guó)Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法

將4 種卵巢標(biāo)本組織芯片進(jìn)行4 μm 切片，敷貼在處理好的載玻片，置入烤箱中加熱（0.5～1 h），采用免疫組化法檢測(cè)4 種卵巢組織中表達(dá)FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白的細(xì)胞比例。判定標(biāo)準(zhǔn)［7］：陽(yáng)性細(xì)胞＞50%為3 分，21%～50%為2 分，10%～20%為1 分，＜10%為0 分；細(xì)胞染色強(qiáng)度：黃褐色為3 分；黃棕色為2 分；淺黃色為1 分，無(wú)黃色為0 分。細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例積分的乘積為最終積分，＜3 分判定為陰性，≥3 分判定為陽(yáng)性。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法［8］

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV-3、3AO 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，每孔100 μL 培養(yǎng)于96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6～8 h，待細(xì)胞貼壁后，調(diào)整培養(yǎng)液，分為只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞的空白對(duì)照組、不含藥培養(yǎng)基的對(duì)照組、FSH 單獨(dú)處理的FSH 組、LY294002 單獨(dú)處理的LY 組及LY294002 作用0.5 h 后聯(lián)合FSH 的FSH/LY 組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。分別培養(yǎng)12、24、48、72 h 后，吸出含藥培養(yǎng)基，采用MTT 法檢測(cè)藥物對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用及其與時(shí)間和濃度的關(guān)系。細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率=（A 加藥-A 空白）/（A 對(duì)照-A 空白）×100%。

1.2.3 Western blot 蛋白印跡法

待上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、3AO 經(jīng)40 mIU/ml FSH（FSH 組）、10 μmol/L LY294002（LY組）、加入LY294002 0.5 h 后聯(lián)合FSH（FSH/LY 組）處理，并設(shè)對(duì)照組，分別于48 和24 h 后倒掉培養(yǎng)液，制作離心上清液，置于-70℃條件下保存，進(jìn)行SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗、二抗、洗膜、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、凝膠圖像分析，觀察FSH 和LY294002 分別及序貫聯(lián)合作用于SKOV-3、3AO 細(xì)胞前后FSHR、AKT1/2、p-AKT、NF-κB 蛋白的表達(dá)。

1.2.4 Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)

調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，每孔上層小室中加200 μL 細(xì)胞懸液，24 孔板槽中加入500 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁后，用FSH 40 mIU/mL 和LY294002 10 μmol/L 分別及序貫聯(lián)合作用于細(xì)胞，48 h 后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察上層小室底部穿過(guò)的細(xì)胞情況并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)對(duì)比，計(jì)量資料以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性模型分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率

上皮性卵巢癌組織FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率：卵巢交界性腫瘤組織＞卵巢良性腫瘤組織＞正常卵巢組織（P＜0.05），卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性組織、正常卵巢組織比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同卵巢組織中FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較［n（%）］Table 1 FSHR，p-Akt，NF in different ovarian tissues-κ Comparison of the positive expression rate of B proteinn［n（%）］

2.2 上皮性卵巢癌組織中FSHR、p-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析，上皮性卵巢癌組織中FSHR 與p-AKT、NF-κB 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.671、0.759，P均＜0.001），p-AKT 與NF-κB 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.718，P＜0.05）。

2.3 FSH 對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用及其與時(shí)間和濃度的關(guān)系

SKOV-3 細(xì)胞于FSH 濃度40 mIU/mL 作用48 h 時(shí)細(xì)胞增殖率最大。不同濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3AO 細(xì)胞于FSH 濃度40 mIU/mL作用24 h 時(shí)細(xì)胞的增殖率最大，最大增殖率為（173.92±1.92）%。不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 FSH 對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用及其與時(shí)間和濃度的關(guān)系（±s）Table 2 growth promoting effect of FSH on SKOV-3 and 3AO cells and its relationship with time and concentration（±s）

表2 FSH 對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用及其與時(shí)間和濃度的關(guān)系（±s）Table 2 growth promoting effect of FSH on SKOV-3 and 3AO cells and its relationship with time and concentration（±s）

注：a vs b vs c vs d vs e P＜0.05；A vs B vs C vs D P＞0.05。

細(xì)胞SKOV-3 細(xì)胞3AO 細(xì)胞FSH（mIU/mL）10a 20b 40c 80d 160e F 值P 值10a 20b 40c 80d 160e F 值P 值12 hA 137.26±0.71 141.02±1.25 143.94±1.00 139.71±0.75 141.65±1.18 193.687＜0.001 106.13±4.12 113.07±2.62 117.45±1.04 114.23±4.36 113.15±1.36 59.722＜0.001 24 hB 145.57±1.06 148.18±0.69 151.82±0.91 143.39±1.03 142.14±1.56 407.135＜0.001 114.11±2.05 139.93±5.90 173.92±1.92 172.15±3.14 154.14±2.54 1671.452＜0.001 48 hC 147.45±0.84 153.17±0.95 166.92±1.24 163.26±0.62 161.05±0.87 2337.144＜0.001 109.72±2.22 127.98±3.05 167.91±3.24 158.38±2.34 140.05±1.53 2673.086＜0.001 72 hD 137.60±2.24 144.58±0.75 151.13±1.32 137.48±0.93 131.79±1.05 960.340＜0.001 109.34±6.52 118.17±3.33 142.04±5.36 130.00±2.10 122.09±3.01 256.143＜0.001

2.4 FSH、LY294002 及聯(lián)合對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞FSHR、p-AKT、AKT1/2、NF-κB 表達(dá)的影響

SKOV-3 細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SH 組p-AKT 蛋白表達(dá)增加，LY294002 組、FSH/LY294002組p-AKT 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；FSH 組NF-κB蛋白表達(dá)高于LY294002 組（P＜0.05）；3AO 細(xì)胞中，LY294002 組、FSH/LY294002 組p-AKT 蛋白表達(dá)少于對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)SH 組p-AKT 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組（P＜0.05）；FSH 組胞核中NF-κB 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組（P＜0.05）；LY294002 組、FSH/LY294002 組少于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；4 組SKOV-3、3AO 細(xì)胞AKT1/2 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 FSH、LY294002 及聯(lián)合對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞FSHR、p-AKT、AKT1/2、NF-κB 表達(dá)的影響Table 3 Effects of FSH，LY294002 and their combination on FSHR，p-Akt，AKT1/2 and NF in SKOV-3 and 3AO cells-κ The influence of B expression

2.5 FSH、FSH/LY、LY 對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞的侵襲性

對(duì)照組、FSH 組、FSH/LY294002 組、LY294002組SKOV-3 細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜平均細(xì)胞數(shù)分別為（26±6）、（118±19）、（38±7）、（18±5）個(gè)/高倍鏡（×200）；3AO 細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜平均細(xì)胞數(shù)分別為（19±4）、（134±20）、（58±11）、（12±3）個(gè)/高倍鏡（×200）。對(duì)照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組兩種細(xì)胞穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)少于FSH 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 FSH、FSH/LY、LY 對(duì)SKOV-3、3AO 細(xì)胞的侵襲性Figure 1 Invasiveness of FSH，F(xiàn)SH /ly and ly on SKOV-3 and 3AO cells

3 討論

國(guó)內(nèi)卵巢癌中80%～90%為上皮性卵巢癌，普遍認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌等因素有關(guān)［9］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中的研究不斷進(jìn)步，細(xì)胞因子及相關(guān)信號(hào)通路與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系為探索腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲提供了新思路、新途徑。

FSH 是腺垂體分泌的糖蛋白激素，主要作用是加速竇前卵泡、竇狀卵泡顆粒細(xì)胞增殖分化，激活顆粒細(xì)胞芳香化酶促進(jìn)雌二醇等物質(zhì)合成、分泌，在女性內(nèi)分泌和生殖功能中具有重要作用［10］。相關(guān)研究表明，F(xiàn)SH 與卵巢癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且在卵巢癌組織表面上皮有FSHR 的表達(dá)，說(shuō)明FSH 的確參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程［11］。本研究結(jié)果顯示，SKOV-3 細(xì)胞于FSH 濃度40 mIU/mL 作用48 h 時(shí)細(xì)胞增殖率最大，具有濃度依賴性，3AO細(xì)胞于FSH 濃度40 mIU/mL 作用24 h 時(shí)細(xì)胞的增殖率最大，具有時(shí)間-濃度依賴性，對(duì)照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組兩種細(xì)胞穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)少于FSH 組，與閆曉楠等［12］研究報(bào)道結(jié)果一致，說(shuō)明FSH 能夠促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、3AO 生長(zhǎng)、增殖、侵襲的作用。本研究還顯示，上皮性卵巢癌組織FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性腫瘤組織、正常卵巢組織，且上皮性卵巢癌組織中FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白之間呈正相關(guān)，提示FSH 在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用可能與p-AKT、NF-κB 蛋白有關(guān)。PI3K/Akt 信號(hào)通路是一種以促增殖、抗凋亡為主要作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中PI3K 屬于磷脂酰肌醇依賴激酶家族成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架構(gòu)筑、細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Akt 屬于該通路最主要的靶酶，活化形式為p-Akt，可抑制細(xì)胞凋亡［13］。已有報(bào)道證實(shí)，NF-κB蛋白作為PI3K/Akt 信號(hào)通路的下游分子，是AKT抗凋亡信號(hào)的靶點(diǎn)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不能及時(shí)凋亡，促使腫瘤細(xì)胞增殖，加速惡性腫瘤發(fā)生［14］。

本研究表明，SKOV-3、3AO 細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SH 組p-AKT 蛋白、胞核中NF-κB 蛋白表達(dá)增加，LY294002 組、FSH/LY294002 組p-AKT 蛋白表達(dá)減少，胞核中NF-κB 蛋白略有減少，說(shuō)明FSH 可能是經(jīng)由PI3K/Akt 通路上調(diào)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、3AO 中NF-κB 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，在PI3K 抑制劑LY294002 的特異性抑制作用下，p-AKT蛋白、胞核中NF-κB 蛋白呈下調(diào)趨勢(shì)。分析原因，可能是由于FSH 通過(guò)結(jié)合細(xì)胞膜上的FSHR，激活PI3K，促使Akt 磷酸化，從而導(dǎo)致PI3K/Akt 信號(hào)通路異常活化，并通過(guò)降解作用促使NF-κB 從復(fù)合物中解離，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，引發(fā)其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而加快細(xì)胞增殖、侵襲，經(jīng)LY294002 處理后FSH 作用被逆轉(zhuǎn)，對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路異常活化產(chǎn)生抑制作用，阻滯NF-κB 核移位，最終下調(diào)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力［15］。因此，F(xiàn)SH-PI3K/AKT 信號(hào)通路-NF-κB 蛋白有望成為臨床治療上皮性卵巢癌的新靶點(diǎn)。

綜上可知，F(xiàn)SH 可能經(jīng)由PI3K/Akt 通路上調(diào)NF-κB 的表達(dá)，促進(jìn)上皮性卵巢癌腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲。