基于分子對接和網絡藥理學探討消栓腸溶膠囊改善血管內皮功能的作用機制

聶玉婷，溫璐璐，司童，劉瑤，高利，曲淼

血管內皮細胞具有分泌、代謝等生理功能，可調節(jié)機體的免疫反應和血流動力學等生理功能[1]。血管內皮損傷是心腦血管病變的重要病理基礎之一，內皮細胞功能失調直接參與高血壓、動脈粥樣硬化、血栓形成等病理過程[2-3]。消栓腸溶膠囊的藥物組成源于補陽還五湯，補陽還五湯具有益氣活血的功效，是卒中恢復期常用的中醫(yī)方劑。已有研究證明補陽還五湯可以增加腦缺血后血管內皮生長因子和整合素αvβ3的表達，促進血管新生，改善神經功能[4]。還有研究顯示補陽還五湯可促進人腦微血管內皮細胞的增殖和遷移，促血管生成[5]。動物實驗提示補陽還五湯可通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt信號通路上調血管內皮細胞生長因子受體2的磷酸化，促進腦出血小鼠的血管生成[6]。目前，消栓腸溶膠囊改善血管內皮功能的機制還不明確。本研究使用分子對接和網絡藥理學方法，探討消栓腸溶膠囊改善血管內皮功能的可能機制，為基礎和臨床研究提供參考。

1 研究方法

1.1 藥物化合物的篩選 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以消栓腸溶膠囊的中藥組成“赤芍”“黃芪”“桃仁”“當歸”“紅花”“川芎”為關鍵詞搜索，設定條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18，分別篩選出符合條件的化合物及相應靶點。消栓腸溶膠囊的一個中藥成分“地龍”在TCMSP中沒有信息，在TCMid數據庫、中藥分子機制的生物信息學分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATman）數據庫、中醫(yī)百科全書（encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM）數據庫中收集地龍化合物信息，配合文獻檢索補充化合物信息，再將化合物放入TCMSP平臺搜索，刪除OB、DL不合格的化合物，刪除在TCMSP、天然產物活性和物種來源數據庫（natural product activity and species source database，NPASS）和Symap數據庫中找不到靶點的化合物，刪除重復化合物。通過通用蛋白資源（universal protein resource，UniProt）數據庫（https：//www.uniprot.org）對靶點進行注釋。

1.2 疾病靶點篩選 以“endothelial dysfunction”“vascular endothelial disorder”“vascular endothelial function”為關鍵詞，在Genecards數據庫（https：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳（online Mendelian inheritance in man，OMIM）數據庫（https：//omim.org）進行檢索，相關性得分設置為≥6，去除重復靶點，篩選血管內皮功能障礙的靶點。將赤芍、黃芪、桃仁、當歸、紅花、川芎、地龍與血管內皮功能障礙靶點基因取交集，得到藥物與血管內皮功能障礙的共同靶點基因。

1.3 藥物-血管內皮功能障礙靶點相互作用網絡和蛋白互作網絡構建 使用Cytoscape 3.8.0軟件對藥物和血管內皮功能障礙靶點進行可視化處理，構建“藥物-關鍵化學成分-血管內皮功能障礙-靶蛋白”網絡關系圖。將藥物與血管內皮功能障礙共同靶點導入STRING數據庫中，設定物種為人類，取中度交互值為0.9，獲取藥物對血管內皮功能障礙的潛在治療靶點的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡。將PPI結果通過Cytoscape 3.8.0軟件進行可視化分析，獲取度值、介度中心性值和緊密中心性值，構建藥物對血管內皮功能障礙潛在治療靶點PPI網絡。

1.4 富集分析 利用R語言分析軟件對篩選得到的藥物-血管內皮功能障礙共有的靶點基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，然后通過繪圖軟件Origin作圖。

1.5 核心活性成分-靶點分子對接驗證 通過分子對接探究天然產物與各靶點的結合方式，這些靶標受體全部從蛋白數據庫（protein data bank，PDB）（https：//www.rcsb.org/；PDB ID：4XZY、5LCY、1JNM）中下載獲得。用于分子對接的小分子從pubchem數據庫下載獲得。本研究采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接工作，在對接開始之前，使用PyMol 2.5對所有受體蛋白進行處理，包括去除水分子、鹽離子以及小分子。并使用PyMol插件center_of_mass.py定義對接盒子的中心，對接盒子的邊長統(tǒng)一定義為22.5。此外，使用ADFRsuite 1.0將所有處理好后的小分子以及受體蛋白轉換為AutoDock Vina 1.1.2對接必須的PDBQT格式。對接時，使用默認對接參數進行對接。輸出的得分最高的對接構象為結合構象，最后使用PyMol 2.5對對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 藥物關鍵化學成分的篩選 在TCMSP數據庫搜索藥物的化學成分，共得到66個化合物和218個靶點，其中川芎關鍵化合物4個，當歸關鍵化合物2個，赤芍關鍵化合物7個，紅花關鍵化合物15個，地龍關鍵化合物1個，黃芪關鍵化合物12個，桃仁關鍵化合物17個，共有化合物8個。

2.2 藥物-疾病靶點 去除重復靶點后，篩選得到血管內皮功能障礙的3120個蛋白靶點基因，將藥物靶點與疾病靶點取交集，得到藥物與血管內皮功能障礙共同靶點基因159個（圖1）。主要共同靶點基因有PGR、NR3C2、PTGS1、PTGS2、NOS2、ESR1、AR、SCN5A、PPARG、F7、KDR、RXRA、ADRB2、ESR2、DPP4、MAPK14、GSK3B、CDK2、CCNA2、NR3C1、DRD1、CHRM3、CHRM1、ADRA1A、ADRA1B、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、ADH1C、ADRA2A、SLC6A2等。

圖1 藥物作用靶點與血管內皮功能障礙靶點交集韋恩圖

2.3 “藥物-關鍵化學成分-血管內皮功能障礙-靶蛋白”網絡構建 使用Cytoscape 3.8.0構建“藥物-關鍵化學成分-血管內皮功能障礙-靶蛋白”可視化網絡圖。在該網絡中，共包含221個節(jié)點，585條邊，56個化合物節(jié)點，6個藥物節(jié)點，159個藥物治療血管內皮功能障礙的潛在靶點（圖2）。根據度值篩選，確定槲皮苷、木樨草素、山柰酚、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、β-谷甾醇、黃芩素、芒柄花黃素、異鼠李素、豆甾醇、β-胡蘿卜素等為消栓腸溶膠囊治療血管內皮功能障礙的主要有效成分（表1）。

表1 藥物化合物度值與來源

圖2 化合物-血管內皮功能障礙靶點相互網絡作用圖

2.4 蛋白互作網絡關系分析 將藥物-血管內皮功能障礙共同的159個靶點基因導入STRING數據庫平臺，研究物種選擇人類，獲取蛋白質相互作用關系，篩選評分＞0.9的蛋白關系，將蛋白互作結果通過Cytoscape 3.8.0軟件進行網絡拓撲結構分析，形成藥物潛在作用靶點蛋白互作網絡圖（圖3）。該網絡包括42個節(jié)點，243條邊。平均度值是11.57，超過平均度值的靶點蛋白有17個（表2），度值排名前5的靶點分別為TP53、MAPK1、JUN、Akt1和MAPK8。這5個關鍵靶點可能在藥物治療血管內皮功能障礙過程中發(fā)揮重要作用，涉及的信號途徑包括血管生成、炎癥、細胞凋亡等。

表2 藥物潛在作用靶點拓撲屬性表

圖3 藥物潛在作用靶點蛋白互作網絡圖

2.5 富集分析

2.5.1 GO富集分析 GO富集分析共獲得 2700條GO生物學過程，從生物過程（biological processes，BP）、分子功能（cellular components，CC）、細胞成分（molecular functions，MF）3個水平對關鍵靶點進行分析，取P＜0.05，以該生物功能富集到的基因數排序，前5條富集結果見圖4。獲得BP相關的條目主要涉及細胞對化學應激的反應、對氧化應激的反應、細胞對氧化應激的反應、對脂多糖的反應、對活性氧的反應等；CC相關的條目主要涉及膜筏、膜微結構域、膜區(qū)等；MF相關的條目主要涉及DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結合轉錄因子結合、核受體活性等。

圖4 藥物潛在作用靶點Go富集分析結果

2.5.2 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結果顯示，消栓腸溶膠囊改善血管內皮細胞功能的關鍵基因靶點主要富集的通路有168條，其中與血管內皮細胞功能密切相關的信號通路有PI3K/Akt、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末產物（advanced glycation end product，AGE）與其受體（receptor for AGE，RAGE）信號通路、IL-17信號通路、TNF-α信號通路、凋亡、Th17細胞分化、TP53信號通路等（圖5）。

圖5 藥物潛在作用靶點京都基因和基因組百科全書通路富集分析結果

2.6 消栓腸溶膠囊改善血管內皮功能活性成分與關鍵靶點的分子對接預測 網絡藥理學預測關鍵靶點為TP53、JUN、MAPK1，使用AutoDock Vina軟件對關鍵靶點與對應化合物進行對接。一般認為配體與受體分子構象越穩(wěn)定，能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。以結合能≤-20.9 kJ/mol為篩選標準，分子對接結果顯示MAPK1與山柰酚、木樨草素、槲皮苷具有最好結合力（表3），使用PyMoL作圖，結果見圖6。

圖6 分子對接圖

表3 有效化合物與作用靶蛋白的結合分數表

3 討論

綜合分析本研究中關鍵靶點、KEGG和GO富集結果，消栓腸溶膠囊可能通過作用于TP53、JUN、MAPK1、AKT1、MAPK8等關鍵靶點，調控PI3K/Akt信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE/RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF-α信號通路、凋亡信號通路、Th17細胞分化、TP53信號通路等，通過調節(jié)血流動力、抗凋亡、抗炎、保護血管及促進血管新生等機制，發(fā)揮改善血管內皮功能的作用。

凋亡是血管內皮細胞的死亡形式之一，TP53參與缺血再灌注后血管內皮細胞凋亡機制的調節(jié)[7]。張建初等[8]發(fā)現在血管緊張素Ⅱ誘導的血管內皮細胞凋亡中，TP53基因的表達明顯增多，認為TP53基因參與了血管緊張素Ⅱ誘導內皮細胞凋亡的調節(jié)。JUN參與血管內皮細胞生長因子的合成，是血管內皮細胞生成反應的關鍵調節(jié)因子之一，而且在血管內皮細胞凋亡過程中發(fā)揮作用[9-10]。Akt是一種多功能的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，Akt1能影響細胞遷移和一氧化氮合成，在血管內皮生長因子介導的血管生成中起到關鍵作用[11]。另外，Akt1能調節(jié)血管通透性、血管生成反應和血管成熟的過程[12]。動物實驗表明，補陽還五湯能增加缺血腦內Akt1 mRNA的表達水平，減輕腦缺血后的腦組織損傷[13]。

流體剪切力在調節(jié)血管內皮細胞功能中有重要作用，研究表明，流體剪切力可上調血管緊張素轉換酶2，抑制內皮細胞增殖和炎癥反應，并促進一氧化氮的產生[14]。高剪切力能降低內皮細胞的動脈粥樣硬化程度，促進血管生成[15]；低切應力可促進氧化應激反應，加重血管內皮功能損傷[16]。

AGE可導致血管內皮細胞功能障礙，有研究證明AGE可通過AGE/RAGE信號通路、p38-MAPK受體信號通路等誘導血管平滑肌細胞鈣化[17]。何林全等[18]在動物實驗中證明加味補陽還五顆?？赏ㄟ^調控高遷移率族蛋白B1/RAGE信號通路發(fā)揮腦保護作用。

血管內皮細胞凋亡與內質網應激密切相關，研究表明PI3K/Akt通路對內質網應激細胞有保護作用[19]。PI3K/Akt通路還可影響血管內皮細胞遷移，抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制腫瘤血管內皮細胞的定向遷移[20]。另外，Kawasaki等[21]的研究也證明PI3K/Akt信號通路有促進血管內皮細胞遷移及產生新生血管的作用。動物實驗中顯示，補陽還五湯可通過PI3K/Akt通路激活血管內皮細胞生長因子受體-2在腦出血誘導的血管生成中起到關鍵作用[6]。

血管內皮細胞損傷后釋放大量細胞因子和炎癥介質參與全身的炎癥反應。Th17是CD4+T細胞亞群之一，分泌IL-17，在促進動脈粥樣硬化斑塊侵蝕或破裂過程中起著重要作用[22-23]。TNF-α等細胞因子的異常可使機體產生慢性低度炎癥狀態(tài)，導致血管內皮細胞功能障礙[24]。吳旋等[25]等的研究證明補陽還五湯可下調腦缺血大鼠TNF-α等炎癥因子的水平，減輕腦缺血后的炎癥反應。

綜上所述，消栓腸溶膠囊具有多成分、多靶點的特點，從單一的通路或靶點難以闡明其改善血管內皮功能的作用機制。本研究運用網絡藥理學技術，系統(tǒng)地闡述了消栓腸溶改善血管內皮功能的活性成分及其可能作用機制，希望為消栓腸溶膠囊的臨床運用提供理論支撐。

【點睛】本研究通過TCMSP等中藥數據庫，GeneCards、OMIM等生物信息數據庫，基于分子對接和網絡藥理學分析了消栓腸溶膠囊改善血管內皮細胞功能的可能靶點及可能機制，有助于后續(xù)針對消栓腸溶膠囊的基礎研究和臨床應用。