正丁基取代芒果苷的合成工藝優(yōu)化及活性預(yù)測

譚邦銀，鄧 松，黎 容，唐 銘，朱 軍，廖洪利*

(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610083；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南 昆明 650500；3.南充市第六人民醫(yī)院，四川 南充 637700)

乙肝是一種易惡變、難康復(fù)、傳染性強的疾病，抗乙肝病毒是治療乙肝的關(guān)鍵。目前臨床常用的抗乙肝病毒藥物主要是核苷類和干擾素，前者易耐藥且治療效果不突出，后者耐受性差，一般需注射給藥[1]，因此，開發(fā)高效低毒且使用方便的抗乙肝病毒藥物具有重要意義。研究表明，芒果苷具有降糖、抑制HepG2肝癌細胞增殖轉(zhuǎn)移[2-3]、抗乙肝病毒[4]等藥理作用。但由于芒果苷油水分配系數(shù)極低，不易被吸收，致使其生物利用度低[5]，限制了其廣泛應(yīng)用。若在芒果苷的3-、6-、7-位羥基引入正丁基，則有助于改善芒果苷的油水分配系數(shù)，進而提高生物利用度，但按文獻報道的合成工藝進行重復(fù)實驗，收率不穩(wěn)定。

因此，作者采用正交實驗優(yōu)化正丁基取代芒果苷合成工藝；再利用AutoDock Vina軟件[6]，通過計算機模擬正丁基取代芒果苷與抗乙肝病毒的靶點HBV核蛋白、HBX結(jié)合蛋白、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白的結(jié)合情況[7-8]，進而預(yù)測正丁基取代芒果苷的抗乙肝病毒活性；以最低結(jié)合能構(gòu)象(優(yōu)勢構(gòu)象)與原構(gòu)象的均方根偏差(RMSD)是否低于2 ?[6]來評價分子對接結(jié)果的可信度；以預(yù)測正丁基取代芒果苷可能具有的尚未被發(fā)現(xiàn)的藥理作用，為后期體外或體內(nèi)實驗提供足夠的理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

芒果苷(批號2020091202)，西安雅圖生物科技有限公司。

溴代正丁烷等試劑，成都市高新區(qū)蔚藍化學(xué)試劑公司。

MP120型全自動熔點儀，ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀，Specord 50 Plus型紫外分光光度儀，KH2200型超聲波清洗器，DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，安捷倫1290型液相色譜-G6400系列三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，DZF-6020型真空干燥箱，EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 正丁基取代芒果苷的合成

正丁基取代芒果苷的合成路線如圖1所示。

圖1 正丁基取代芒果苷的合成路線

取0.42 g(1 mmol)芒果苷于100 mL圓底燒瓶中，加入12 mL無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，置于恒溫油浴鍋中，攪拌使芒果苷溶解澄清；再加入研細的無水碳酸鉀(縛酸劑)粉末0.50 g(3.6 mmol)、溴代正丁烷0.34 mL(約3 mmol)，40 ℃攪拌反應(yīng)(接冷凝管、干燥管)5 h，期間反應(yīng)液顏色逐漸加深；TLC監(jiān)測反應(yīng)，當原料點幾乎完全消失、出現(xiàn)Rf值比原料點更大的產(chǎn)物點時停止反應(yīng)，向反應(yīng)液中加入80 mL乙酸乙酯，攪拌均勻后移至500 mL分液漏斗中；再加入100 mL 2%KOH溶液，充分振搖，靜置分層后，分離上層有機相；稱取3 g無水硫酸鎂加入有機相中，振搖，靜置2 h；抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋至體積不再減少或得到黃色油狀固體；加入20 mL石油醚，超聲，析出固體；-18 ℃冷凍12 h，抽濾，置于烘箱中40 ℃干燥1 h，得正丁基取代芒果苷粗品，稱重。

1.3 正丁基取代芒果苷的收率計算

精密稱量12.30 mg正丁基取代芒果苷粗品于25 mL干燥錐形瓶中，加入3.00 mL乙酸乙酯，超聲溶解；加入1.50 mL石油醚，搖勻；再加入0.060 7 g硅膠粉(300～400目)，振搖，靜置0～1 min；抽濾，取濾液0.21 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得樣品溶液。測定樣品溶液在262 nm處的吸光度，依據(jù)標準曲線方程A=0.056c-0.0196(R2=0.9997)計算樣品溶液中正丁基取代芒果苷的濃度，按下式計算正丁基取代芒果苷收率(本實驗以粗品中正丁基取代芒果苷的質(zhì)量表征收率W，mg)：

式中：c為依據(jù)標準曲線方程計算的正丁基取代芒果苷的濃度，μg·mL-1；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液總體積，mL；m1為稱取粗品的質(zhì)量，mg；m2為合成粗品的總質(zhì)量，mg。

1.4 正丁基取代芒果苷的合成工藝優(yōu)化

在前期研究的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時間(A)、反應(yīng)溫度(B)、投料比(芒果苷與溴代正丁烷物質(zhì)的量比，C)、縛酸劑用量(D)為考察因素，以正丁基取代芒果苷收率(W)為考核指標，采用L16(44)正交實驗優(yōu)化正丁基取代芒果苷的合成工藝。正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平

1.5 正丁基取代芒果苷的抗乙肝病毒活性預(yù)測

利用AutoDock Vina軟件[6]，在Microsoft Windows 2007操作系統(tǒng)中，運用ChemBioDraw和ChemBio 3D獲得能量最小化的芒果苷和正丁基取代芒果苷的3D結(jié)構(gòu)。在PBD數(shù)據(jù)庫中檢索并下載與抗乙肝病毒復(fù)制、感染相關(guān)的靶點蛋白：HBV核蛋白(PBD ID：5E0I)、HBX結(jié)合蛋白(HBXIP)(PBD ID：3MS6)、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白(PBD ID：5FCG)；通過Pymol軟件打開各靶點3D模型，保留各靶點自身所帶有的配體，刪除各靶點中的其它配體分子及水分子，導(dǎo)出為受體pdb文件。分別將受體和配體導(dǎo)入AutoDock tool中，加氫，計算電荷，設(shè)置對接參數(shù)，進行Vina分子對接。待程序結(jié)束，運用Pymol軟件，計算優(yōu)勢構(gòu)象與原構(gòu)象的RMSD值。以RMSD值是否低于2 ?來評價分子對接結(jié)果的可信度，以預(yù)測正丁基取代芒果苷可能具有的尚未被發(fā)現(xiàn)的藥理作用。

將正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與抗乙肝病毒靶點的復(fù)合物導(dǎo)入Pymol軟件中，分析正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與靶點具體氨基酸殘基形成的氫鍵以及氫鍵的長度，繪制正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與靶點活性空腔結(jié)合的3D圖及正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與靶點氨基酸殘基的氫鍵及其它作用力的2D圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實驗結(jié)果

采用L16(44)正交實驗優(yōu)化正丁基取代芒果苷的合成工藝，結(jié)果與分析見表2。

表2 正交實驗的結(jié)果與分析

由表2可知，4個因素對正丁基取代芒果苷收率的影響大小依次為反應(yīng)溫度(B)>反應(yīng)時間(A)>投料比(C)>縛酸劑用量(D)。在實驗選定的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，分析均值的變化趨勢，綜合考慮合成成本，得到正丁基取代芒果苷的最優(yōu)合成工藝組合是A2B4C3D3，即反應(yīng)時間4 h、反應(yīng)溫度60 ℃、芒果苷與溴代正丁烷物質(zhì)的量比1∶6.0、縛酸劑碳酸鉀用量0.58 g。

2.2 驗證實驗

在最優(yōu)工藝條件下，進行2次驗證實驗，正丁基取代芒果苷收率分別為177.42 mg和183.72 mg，均大于16次正交實驗中的最大值。表明，采用正交實驗優(yōu)化的合成工藝合理可行，正丁基取代芒果苷收率可觀且相對穩(wěn)定。

2.3 抗乙肝病毒活性預(yù)測結(jié)果

分子模擬芒果苷、正丁基取代芒果苷與抗乙肝病毒的靶點HBV核蛋白、HBX結(jié)合蛋白、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白的結(jié)合情況，最低結(jié)合能及RMSD值見表3。

表3 分子模擬的最低結(jié)合能及RMSD值

由表3可知，芒果苷、正丁基取代芒果苷與抗乙肝病毒各靶點的結(jié)合能均低于-6.0 kcal·mol-1，其中與核心靶點HBV核蛋白的結(jié)合能最低，分別為-8.9 kcal·mol-1和-8.7 kcal·mol-1；各優(yōu)勢構(gòu)象與原構(gòu)象的RMSD值均低于2 ?，提示正丁基取代芒果苷可能具有一定的抗乙肝病毒活性。

2.4 正丁基取代芒果苷與抗乙肝病毒靶點結(jié)合情況

對正丁基取代芒果苷與HBV核蛋白、HBX結(jié)合蛋白、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白等3個靶點的對接結(jié)果進行分析，分別繪制正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與靶點的結(jié)合情況、優(yōu)勢構(gòu)象與靶點活性空腔的適應(yīng)情況、優(yōu)勢構(gòu)象與靶點氨基酸殘基的作用力情況，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，正丁基取代芒果苷能夠與抗乙肝病毒靶點很好地結(jié)合(圖2a～c)；并順利進入3個靶點的活性區(qū)域(圖2d～f)；與附近的靶點氨基酸殘基形成氫鍵及其它類型的作用力，其中與HBV核蛋白的102、106、121、156等4個氨基酸殘基形成氫鍵，與HBX結(jié)合蛋白的8、12、23等3個氨基酸殘基形成氫鍵，而與Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白形成氫鍵較少，只與145氨基酸殘基有1個氫鍵結(jié)合(圖2g～i)。

a、b、c分別為正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與HBV核蛋白、HBX結(jié)合蛋白、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白的結(jié)合情況d、e、f分別為正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與HBV核蛋白、HBX結(jié)合蛋白、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白活性空腔的適應(yīng)情況g、h、i分別為正丁基取代芒果苷優(yōu)勢構(gòu)象與HBV核蛋白、HBX結(jié)合蛋白、Bcl-2與HBX-BH3復(fù)合體結(jié)晶蛋白氨基酸殘基的作用力情況

2.5 討論

乙肝是一種慢性疾病，全球共有3.5億乙肝患者，而中國是感染人數(shù)最多的37個國家之一[9]。臨床常用的治療方法是抗病毒治療，其治療周期長，常用的抗病毒藥物核苷類和干擾素，長期使用都有一定缺陷。本研究采用分子對接的方式，在理論上驗證了正丁基取代芒果苷具有與芒果苷相似的抗乙肝病毒活性，且經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾后，其油水分配系數(shù)較芒果苷有很大的改善，具有良好的研究前景。但其原有的合成工藝存在收率不穩(wěn)定的缺點。因此，本研究采用正交實驗對原合成工藝進行優(yōu)化，最終獲得了一條可以降低成本、提高收率穩(wěn)定性的合成工藝。

3 結(jié)論

以芒果苷和溴代正丁烷為原料，合成正丁基取代芒果苷，采用L16(44)正交實驗優(yōu)化合成工藝，確定最優(yōu)合成工藝如下：反應(yīng)時間4 h、反應(yīng)溫度60 ℃、芒果苷與溴代正丁烷物質(zhì)的量比1∶6.0、芒果苷用量1 mmol、縛酸劑碳酸鉀用量0.58 g，在此條件下，2次驗證實驗得到的正丁基取代芒果苷收率分別為177.42 mg和183.72 mg。正丁基取代芒果苷與抗乙肝病毒各靶點的結(jié)合能均低于-6.0 kcal·mol-1，其中與核心靶點HBV核蛋白的結(jié)合能最低(-8.7 kcal·mol-1)，各優(yōu)勢構(gòu)象與原構(gòu)象的均方根偏差(RMSD)均低于2 ?，對接結(jié)果可信度較高。通過分子對接預(yù)測了正丁基取代芒果苷的抗乙肝病毒活性，為該類化合物的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。