氨基酸序列比對(duì)分析IL-12的種屬特異性

陳麗娜，王建剛，王亞俊，秦 歡，丁會(huì)芹,*

(1.康立泰生物醫(yī)藥(青島)有限公司，山東 青島 266112；2.青島大學(xué)，山東 青島 266001)

目前市場(chǎng)上尚未有任何一種上市藥物能夠單品種、單次劑量實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)免疫功能且能夠同時(shí)促進(jìn)全血象恢復(fù)。臨床上常需將多種藥物或治療方式聯(lián)合，治療方案復(fù)雜且效果有限。白介素-12(interleukin-12，IL-12)是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，具有明確的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)功能，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠促進(jìn)造血功能全面恢復(fù)的細(xì)胞因子類(lèi)藥物[1]。IL-12同時(shí)具有抗腫瘤[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]及血象恢復(fù)[4]等作用，能夠填補(bǔ)臨床治療的空白。重組人白介素-12(rhIL-12)產(chǎn)品在全球范圍內(nèi)還未上市，是真正意義上的國(guó)家一類(lèi)創(chuàng)新藥物，其市場(chǎng)潛力巨大。rhIL-12蛋白結(jié)構(gòu)與天然IL-12的一致，是由α亞基和β亞基經(jīng)1個(gè)二硫鍵共價(jià)結(jié)合而成的異二聚體糖蛋白。α亞基由197個(gè)氨基酸組成，包含7個(gè)半胱氨酸殘基和3個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)；β亞基由306個(gè)氨基酸組成，包括10個(gè)半胱氨酸殘基和4個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)[5]。

生物技術(shù)藥物的生物學(xué)活性通常與種屬和/或組織特異性相關(guān)，因此應(yīng)進(jìn)行報(bào)審前的非臨床藥效研究及安全性評(píng)價(jià)，以闡明藥理學(xué)及毒理學(xué)等特征[6]。這就需要確定能夠預(yù)測(cè)臨床風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)種屬或動(dòng)物模型，在進(jìn)行非臨床藥效研究和安全性評(píng)價(jià)前，需關(guān)注種屬間IL-12氨基酸序列的特異性及其同源性，并進(jìn)行氨基酸信息學(xué)比對(duì)分析。為此，作者通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索人、鼠、兔、犬和猴的IL-12氨基酸序列，運(yùn)用ClustalW及Espript軟件進(jìn)行兩序列比對(duì)，運(yùn)用Blat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多序列比對(duì)，為IL-12產(chǎn)品以及相關(guān)衍生產(chǎn)品的非臨床研究和評(píng)價(jià)中動(dòng)物種屬的選擇提供依據(jù)，以指導(dǎo)新藥產(chǎn)品的注冊(cè)申報(bào)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)分別輸入關(guān)鍵詞“IL-12 α”和“IL-12 β”，獲得蛋白質(zhì)氨基酸序列，選擇小鼠、大鼠、兔、犬、食蟹猴及人的IL-12氨基酸序列，排除“同物種序列”、“相似序列”及其它不相關(guān)序列；其中，人IL-12氨基酸序列去除信號(hào)肽序列。

1.2 方法

采用ClustalW及Espript軟件將獲取的人IL-12氨基酸序列與各種屬I(mǎi)L-12氨基酸序列進(jìn)行兩序列比對(duì)。即分別將人與另一種動(dòng)物的IL-12氨基酸序列復(fù)制到ClustalW軟件中，點(diǎn)擊“Execute Multiple Alignment”運(yùn)行軟件，獲得兩序列比對(duì)文件，將所得文件上傳至Espript軟件，點(diǎn)擊“Submit”獲得兩序列比對(duì)結(jié)果文件。

采用Blat數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)依次選擇小鼠、大鼠、兔、犬、恒河猴、食蟹猴數(shù)據(jù)庫(kù)并輸入獲取的人IL-12氨基酸序列，點(diǎn)擊“Submit”運(yùn)行數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行多序列比對(duì)；另外，選擇人數(shù)據(jù)庫(kù)并輸入獲取的5種動(dòng)物種屬的IL-12氨基酸序列，運(yùn)行數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多序列比對(duì)。完成比對(duì)后，分析人IL-12與各種屬I(mǎi)L-12的同源性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 各種屬I(mǎi)L-12氨基酸序列檢索結(jié)果

在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到與IL-12 α亞基氨基酸相關(guān)序列共435個(gè)，與IL-12 β亞基氨基酸相關(guān)序列共737個(gè)，排除“同物種序列”、“相似序列”及其它不相關(guān)序列。選擇非臨床研究中常用5種動(dòng)物的IL-12 α亞基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43431)、大鼠(rat，Q9R103)、兔(rabbit，A0A5F9CIX7)、犬(dog，F(xiàn)1PPC0)、食蟹猴(crab-eating macaque，A0A2K5V4L8)；選擇5種動(dòng)物的IL-12 β亞基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43432)、大鼠(rat，Q9R278)、兔(rabbit，G1TBD7)、犬(dog，F(xiàn)1PK70)、食蟹猴(crab-eating macaque，G7P6S2)。選擇人的IL-12 α亞基(human，p29459)及IL-12 β亞基(human，p29460)氨基酸序列，去除信號(hào)肽序列，即分別為197個(gè)氨基酸的IL-12 α亞基及306個(gè)氨基酸的IL-12 β亞基。

2.2 兩序列比對(duì)結(jié)果

采用ClustalW及Espript軟件比對(duì)人與5種動(dòng)物的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列，兩序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 人與5種動(dòng)物的IL-12氨基酸序列比對(duì)結(jié)果/%

相似性數(shù)值越大，表明同源性越高。由表1可以看出，IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列同源性在人與小鼠之間分別為80.47%、84.84%，在人與大鼠之間分別為81.40%、84.37%，在人與兔之間分別為88.81%、91.01%，在人與犬之間分別為90.32%、91.95%，在人與食蟹猴之間分別為87.15%、95.88%。其中，人與食蟹猴的IL-12氨基酸序列同源性相對(duì)較高。

人與食蟹猴的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列比對(duì)見(jiàn)圖1。

注：深色背景序列表示人與食蟹猴相同的IL-12氨基酸序列

2.3 多序列比對(duì)結(jié)果

采用Blat數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)人IL-12與6種動(dòng)物數(shù)據(jù)庫(kù)的氨基酸序列，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人IL-12與6種動(dòng)物數(shù)據(jù)庫(kù)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

得分越高，種屬一致性越高。由表2可以看出，人的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與恒河猴的一致性分別高達(dá)94.0%、96.2%，與食蟹猴的一致性分別高達(dá)92.8%、96.2%，與其它種屬的一致性相對(duì)較低。選擇人IL-12 β亞基氨基酸序列與食蟹猴數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)時(shí)，產(chǎn)生了4個(gè)食蟹猴氨基酸的匹配位置數(shù)據(jù)，第一個(gè)匹配數(shù)據(jù)表2中有顯示，另外3個(gè)得分都很低，并且跨度≤15 bp(base pair，堿基對(duì))，雖然一致性均為100%，但這些匹配可能具有偶然性，不能代表人的IL-12 β亞基氨基酸序列與此位置有真正關(guān)系。

采用Blat數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)5種動(dòng)物IL-12與人數(shù)據(jù)庫(kù)的氨基酸序列(表3)。分析一致性發(fā)現(xiàn)，5種動(dòng)物的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與人的一致性大小順序依次為食蟹猴>犬>兔>大鼠>小鼠。

表3 5種動(dòng)物IL-12與人數(shù)據(jù)庫(kù)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.4 討論

IL-12是一種異源二聚體蛋白，具有與二硫鍵共價(jià)結(jié)合的α亞基和β亞基，是一種有效的抗腫瘤藥物。能夠通過(guò)刺激CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，刺激抗原遞呈細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的遞呈作用，促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞等IFN-γ分泌作用，抑制腫瘤血管生成等多種途徑增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫作用，甚至可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身抗腫瘤的“遠(yuǎn)端效應(yīng)”和“免疫記憶”[7-9]。目前，已證實(shí)IL-12是唯一能夠促進(jìn)骨髓造血系統(tǒng)全血象長(zhǎng)久恢復(fù)的細(xì)胞因子，也是唯一能在輻射后24 h給藥仍然顯示全血象恢復(fù)功能的細(xì)胞因子[10-11]。IL-12還具有抗病毒[12]、抗肝炎[13]、抗寄生蟲(chóng)[14]、抗哮喘[15]等多種生物學(xué)活性，其通過(guò)一系列復(fù)雜的作用機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用。

多數(shù)生物技術(shù)藥物在蛋白質(zhì)水平具有嚴(yán)格的種屬特異性，導(dǎo)致相應(yīng)的一般藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)評(píng)價(jià)及毒理學(xué)研究都存在種屬特異性問(wèn)題。因而此類(lèi)藥物的非臨床研究及安全性評(píng)價(jià)的主要挑戰(zhàn)就是確定相關(guān)種屬或動(dòng)物模型。采用相關(guān)種屬進(jìn)行非臨床研究及安全性評(píng)價(jià)有助于預(yù)測(cè)產(chǎn)品在臨床試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的治療效果及不良反應(yīng)。

3 結(jié)論

分別采用了兩序列比對(duì)及多序列比對(duì)的方式進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，雖然不同方式得出的一致性數(shù)據(jù)存在差異，但總體上，人的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與常用種屬的同源性大小順序均為猴源>犬源>兔源>鼠源。即人的IL-12氨基酸序列與恒河猴、食蟹猴的一致性較高，與其它種屬的一致性普遍較低，因此存在種屬特異性。研究結(jié)果提示，IL-12產(chǎn)品以及相關(guān)衍生產(chǎn)品的藥理、藥效研究以及需種屬相關(guān)性動(dòng)物進(jìn)行的安全性評(píng)價(jià)應(yīng)該在食蟹猴或恒河猴身上進(jìn)行，才能獲得有意義于申報(bào)臨床及上市的試驗(yàn)結(jié)果。