徐小娜,牛海青,王曉霞,田 晴,高 茜,蘇 春
(1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712000;2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710119)
海洋占地球表面積的70%,擁有非常豐富的微生物資源[1]。高壓、低溫、氧氣和鹽含量分布不均勻、營(yíng)養(yǎng)匱乏、環(huán)境復(fù)雜等特殊性造就了海洋放線(xiàn)菌獨(dú)特復(fù)雜的代謝途徑,使得海洋放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、復(fù)雜多樣和生物活性較高[2]。人們從19世紀(jì)20年代開(kāi)始對(duì)海洋放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,大多集中在抗腫瘤、抗病毒和抗菌等方面,對(duì)抗補(bǔ)體活性方面的研究非常少。
補(bǔ)體系統(tǒng)是由30多種膜結(jié)合性蛋白、補(bǔ)體受體和可溶性蛋白組成的多分子系統(tǒng),是存在于正常動(dòng)物和人組織液及血清中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體系統(tǒng)的主要組分為C1~C9化合物,激活途徑主要有3種:經(jīng)典途徑(classical pathway,CP)、旁路途徑(alternative pathway,AP)和凝集素途徑(lectin pathway,LP)[3]。但是,補(bǔ)體異常激活會(huì)引起許多疾病,如阿爾茲海默癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等,其過(guò)度激活也會(huì)對(duì)紅細(xì)胞、血管、腎臟和關(guān)節(jié)等組織造成實(shí)質(zhì)性損傷[4]。所以,抗補(bǔ)體活性藥物的研發(fā)引起了人們的廣泛關(guān)注。目前,臨床上普遍使用甲胺蝶呤、糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑治療某些與補(bǔ)體異常激活相關(guān)的疾病,但這些抑制劑并非專(zhuān)一的補(bǔ)體抑制劑,選擇性較差,長(zhǎng)期使用會(huì)造成機(jī)體的防御機(jī)能降低,從而造成抗感染能力下降,容易使?jié)撛诓≡顢U(kuò)散和繼發(fā)感染,并產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥[5]。所以,臨床醫(yī)學(xué)上急需具有高效、低毒和專(zhuān)一等特性的補(bǔ)體抑制劑。
作者以抗補(bǔ)體活性為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化海洋放線(xiàn)菌S187產(chǎn)抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝,擬為海洋放線(xiàn)菌S187抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。
海洋放線(xiàn)菌S187,采自大連星海灣海底沉積物,保存于-80 ℃冰箱。
TSB培養(yǎng)基(M1)(g·L-1):胰蛋白胨 17,大豆蛋白胨 3,葡萄糖 5,NaCl 5,K2HPO42.5,自然pH值。
二號(hào)培養(yǎng)基(M2)(g·L-1):葡萄糖 10,可溶性淀粉 20,牛肉膏 3,蛋白胨 5,酵母提取物 5,(NH4)2SO45,CaCO34,pH值7.5。
ISP4培養(yǎng)基(M3)(g·L-1):可溶性淀粉 10,(NH4)2SO42,K2HPO41,NaCl 1,蛋白胨 1,酵母粉 0.5,CaCO32,微量元素 100 μL,pH值7.2~7.5。
ISP2培養(yǎng)基(M4)(g·L-1):酵母提取物 4,麥芽提取物 10,葡萄糖 4,pH值7.2~7.5。
AM2ab 培養(yǎng)基(M5)(g·L-1):大豆粉 5,酵母粉 5,可溶性淀粉 20,蛋白胨 2,CaCO32,pH值7.2~7.5。
RA培養(yǎng)基(M6)(g·L-1):麥芽提取物10,葡萄糖 10,玉米粉 5,可溶性淀粉 20,麥芽糖 10,微量元素 100 μL,pH值7.2~7.5。
豆粉培養(yǎng)基(M7)(g·L-1):可溶性淀粉 20,大豆粉 25,(NH4)2SO42,NaCl 2,K2HPO40.5,CaCO35,pH 值7.2。
A1培養(yǎng)基(M8)(g·L-1):可溶性淀粉 10,酵母粉 4,蛋白胨 2,人造海鹽 28(可用75%的海水代替人造海鹽),自然pH值。
九號(hào)培養(yǎng)基(M9)(g·L-1):玉米粉 30,大豆粉 7,KNO31.5,K2HPO40.5,pH值7.5。
大豆粉先煮沸,用8層紗布過(guò)濾后再加入到培養(yǎng)基中;微量元素(mg·L-1):ZnCl2800,F(xiàn)eCl3·6H2O 4 000,CuCl2·2H2O 200,MnCl2·4H2O 200,NaB4O7·10H2O 200;配制固體培養(yǎng)基均加入2%瓊脂;所有培養(yǎng)基均用滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。
1.2.1 菌種活化及種子液的制備
菌種活化:取保存于-80 ℃冰箱中的菌懸液1 mL,涂布于M9固體培養(yǎng)基平板上,于28 ℃培養(yǎng)4~8 d。
種子液的制備:用接種環(huán)從平板上刮取1 cm2活化的菌株S187孢子,接種于裝有50 mL M1液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)2 d。
1.2.2 樣品制備
種子液經(jīng)離心后,得到上清液和菌絲體;用乙酸乙酯反復(fù)萃取上清液3次;用甲醇-丙酮(體積比1∶1)過(guò)夜破壁浸提菌絲體,減壓蒸餾得到菌絲體水溶液,再用等體積的乙酸乙酯反復(fù)萃取3次;將上述兩個(gè)乙酸乙酯萃取液合并,濃縮得到浸膏;再用5% 二甲基亞砜溶液超聲溶解、稀釋?zhuān)玫綕舛葹?.06 mg·mL-1的菌株S187代謝產(chǎn)物的粗提物。
1.2.3 菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性測(cè)定
(1)5倍巴比妥緩沖液(5×BBS):取2.875 g巴比妥鈉溶于250 mL熱水中,加入42.5 g NaCl、0.84 g MgCl2·6H2O、0.14 g CaCl2、1.0 g巴比妥,再加入三蒸水至1 000 mL,即得。實(shí)驗(yàn)時(shí)將5×BBS緩沖液直接稀釋成1×BBS緩沖液。
(2)2%綿羊紅細(xì)胞(2%SRBC):取2 mL綿羊血,用1×BBS緩沖液洗滌后,3 000 r·min-1離心5 min,重復(fù)洗滌3次,再補(bǔ)加1×BBS緩沖液至2 mL,混勻;取約0.5 mL于紅細(xì)胞的壓積管中,3 000 r·min-1離心10 min,測(cè)定綿羊紅細(xì)胞的體積百分比,加入適量1×BBS緩沖液配制成2%SRBC。
(3)溶血素(效價(jià)1∶4 000):實(shí)驗(yàn)時(shí)用1×BBS緩沖液將效價(jià)1∶4 000的溶血素稀釋成1∶1 000。
采用經(jīng)典途徑溶血法[6-7]測(cè)定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性:將樣品與補(bǔ)體混合均勻,置于37 ℃水浴鍋中水浴10 min;按表1加入1×BBS緩沖液、溶血素和2%SRBC,于37 ℃水浴30 min后,放在冰上冷卻;于4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min,取上清液0.2 mL于96孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值。同時(shí)設(shè)置樣品對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組。將樣品組的OD405值扣除相應(yīng)樣品對(duì)照組的OD405值后計(jì)算溶血抑制率(抑制率越高,抗補(bǔ)體活性越高)。按下式計(jì)算抗補(bǔ)體活性:
表1 經(jīng)典途徑溶血法測(cè)定抗補(bǔ)體活性實(shí)驗(yàn)中各處理組成分/mL
1.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化
以抗補(bǔ)體活性為評(píng)價(jià)指標(biāo),先分別考察碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、初始pH值對(duì)菌株S187代謝產(chǎn)物抗補(bǔ)體活性的影響;然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取碳源含量、氮源含量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH值為考察因素,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株S187產(chǎn)抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝,利用SAS軟件分析數(shù)據(jù)。
取3 mL種子液分別接種于M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8等8種液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)6 d,測(cè)定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性,結(jié)果如圖1所示。
圖1 菌株S187在不同培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性
從圖1可以看出,菌株S187在M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性最高。因此,選擇M7培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化。
2.2.1 碳源對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它成分不變的條件下,分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶性淀粉,測(cè)定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性,考察碳源對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響,結(jié)果如圖2所示。
圖2 碳源對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
從圖2可以看出,以可溶性淀粉為碳源時(shí),菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性最高,其次是葡萄糖、蔗糖和麥芽糖;以乳糖為碳源時(shí)的抗補(bǔ)體活性最低。因此,確定最佳碳源為可溶性淀粉。
2.2.2 氮源對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它成分不變的條件下,分別以花生粉、蛋白胨、玉米粉和牛肉粉等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的大豆粉,測(cè)定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性,考察氮源對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響,結(jié)果如圖3所示。
圖3 氮源對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
從圖3可以看出,以大豆粉為氮源時(shí),菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性最高,其次是玉米粉、花生粉和牛肉粉;以蛋白胨為氮源時(shí)的抗補(bǔ)體活性最低。因此,確定最佳氮源為大豆粉。
2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
將種子液按6%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,于28 ℃、220 r·min-1下分別發(fā)酵3 d、4 d、5 d、6 d、7 d,測(cè)定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性,考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響,結(jié)果如圖4所示。
圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
從圖4可以看出,發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性影響較大;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),抗補(bǔ)體活性呈先升高后降低的趨勢(shì),在發(fā)酵第6 d時(shí),抗補(bǔ)體活性達(dá)到最高。這是因?yàn)?,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的產(chǎn)量逐漸增多,抗補(bǔ)體活性相應(yīng)逐漸升高;但發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),抗補(bǔ)體活性物質(zhì)逐漸被消耗,抗補(bǔ)體活性反而會(huì)降低。因此,發(fā)酵時(shí)間以6 d為宜。
2.2.4 初始pH值對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
將基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始 pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,將種子液按6%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,28 ℃、220 r·min-1下發(fā)酵6 d,測(cè)定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性,考察初始pH值對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響,結(jié)果如圖5所示。
圖5 初始pH值對(duì)抗補(bǔ)體活性的影響
從圖5可以看出,當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH值為7.0時(shí),菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性最高,進(jìn)一步證明,在發(fā)酵過(guò)程中,只有在合適的環(huán)境下,菌株才能正常生長(zhǎng)并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物;當(dāng)初始pH值低于7.0或者高于7.0時(shí),代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性均有不同程度的降低。因此,基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH值以7.0為宜。
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取可溶性淀粉含量(A)、大豆粉含量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)、初始pH值(D)為考察因素,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株S187產(chǎn)抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝。正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。
表2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析
從表2、3可以看出,各因素對(duì)抗補(bǔ)體活性影響的大小順序依次為D>B>C>A;因素B和D有顯著性差異,因素A和C沒(méi)有顯著性差異。結(jié)合極差分析,最終確定最佳發(fā)酵工藝為A2B3C3D3,即可溶性淀粉20 g·L-1、大豆粉35 g·L-1、發(fā)酵時(shí)間7 d、初始pH值7.5。
分別稱(chēng)取20 g·L-1可溶性淀粉、35 g·L-1大豆粉,基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分不變,調(diào)節(jié)初始pH值為7.5,發(fā)酵7 d,進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。測(cè)得菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性分別為69.35%、69.38%、69.33%,平均抗補(bǔ)體活性為69.35%。表明該工藝穩(wěn)定可靠。
采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了海洋放線(xiàn)菌S187產(chǎn)抗補(bǔ)體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝。確定最佳發(fā)酵工藝為:可溶性淀粉20 g·L-1,大豆粉35 g·L-1,(NH4)2SO42 g·L-1,NaCl 2 g·L-1,K2HPO40.5 g·L-1,CaCO35 g·L-1,初始pH值7.5,于28 ℃、220 r·min-1下發(fā)酵7 d。在此條件下,海洋放線(xiàn)菌S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性為69.35%。為海洋放線(xiàn)菌S187代謝產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。