胭脂魚核連蛋白2/Nesfatin-1基因克隆及其在間腦與肝胰臟中的差異表達(dá)

蘇時萍，李卿青，謝啟明，劉帆，張君，李西雷

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036）

核連蛋白2（nucleobindin-2,NUCB2）經(jīng)激素原轉(zhuǎn)化酶作用于特定位點后，可裂解產(chǎn)生82個氨基酸的神經(jīng)肽Nesfatin-1，又稱厭食肽[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1發(fā)揮主要生物學(xué)功能的區(qū)域為第23—53氨基酸片段，稱為M30[2]。至今，前體NUCB2 已在金魚（Carassius auratus）[3]、斑馬魚（Danio rerio）[4]和西伯利亞鱘（Acipenser baerii）[5]等魚類中被成功克隆。NUCB2主要分為信號肽、Nesfatin-1、Nesfatin-2和Nesfatin-3 4 個氨基酸區(qū)域，且在人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）間有較高的保守性[6]。Nesfatin-1 主要分布于人和其他動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)如下丘腦室旁核、弓狀核、視上核、下丘腦外側(cè)區(qū)等部位[7-9]，在食道、胃、肝胰臟、腸道、卵巢、心臟等的外周組織中也有豐富表達(dá)[3,10-11]。有研究表明，Nesfatin-1 除具有中樞性主動抑制攝食和生殖調(diào)控作用[12-13]外，還具有調(diào)控葡萄糖代謝[14]、脂肪代謝[13,15]、胃腸道運動[12,16]等重要的生物學(xué)功能。對金魚和斑馬魚禁食后發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1 在二者腦中的表達(dá)量降低，而在其肝胰臟中的表達(dá)量顯著增加[3-4]，證明Nesfatin-1 在中樞抑制攝食作用下和在被動缺食情況下，會誘發(fā)魚類肝胰臟Nesfatin-1 的高表達(dá)，從而促進(jìn)血糖升高，緩沖體內(nèi)由食物缺乏造成的代謝壓力。

中國胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus），是胭脂魚屬在亞洲的唯一種，為我國Ⅱ級保護(hù)動物，僅分布于長江水系和閩江水系[17]。中國胭脂魚是一種古老的魚類，在魚類系統(tǒng)分類學(xué)和動物地理研究上有重要的科研價值，并具有極高的經(jīng)濟(jì)價值。近年來，環(huán)境因素導(dǎo)致胭脂魚自然種群數(shù)量急劇下降，其主要的保護(hù)措施是人工放流[18]。雖然胭脂魚人工馴養(yǎng)與繁殖已取得成功，但由于親本培育與人工繁殖技術(shù)不太成熟，相關(guān)理論研究也比較缺乏，造成人工苗種產(chǎn)量不穩(wěn)定。本研究在克隆中國胭脂魚NUCB2基因序列、分析其核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）技術(shù)對Nesfatin-1 在胭脂魚快速生長期（3齡）和性成熟期（6 齡）的間腦和肝胰臟中的表達(dá)變化進(jìn)行檢測，目的是探索Nesfatin-1 在胭脂魚快速生長期和性成熟期的時空表達(dá)差異，為全面研究和揭示魚類NUCB2 基因的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)信息，也為深入研究Nesfatin-1 對魚類不同生長發(fā)育階段調(diào)控作用的差異性提供基本素材，為后續(xù)進(jìn)一步完善胭脂魚親本培育技術(shù)提供基本信息資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用3 齡[（2.1±0.29）kg]和6 齡[（5.32±0.47）kg]各6尾的雌性胭脂魚均采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所（湖北省荊州市）養(yǎng)殖基地。解剖前用0.05%的魚用麻醉劑間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）（美國Sigma-Aldrich公司）浸泡麻醉5 min，取供試的12 尾胭脂魚左半側(cè)腦和肝胰臟組織，分別浸沒于含RNAstore[天根生化科技（北京）有限公司]無核酸酶凍存管中，先后分別于4 ℃與－20 ℃條件下保存24 h后，置于－80 ℃冰箱中保存，用于總RNA 提?。粚⒄〉挠野雮?cè)腦和剩余的肝胰臟組織置于4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）中，固定24 h后，分別轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液和80%乙醇溶液中，于4 ℃條件下保存，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 的提取與第1 鏈cDNA 的合成

使用RNAiso Plus 試劑盒（日本TaKaRa 公司），按其說明步驟，分別從胭脂魚腦和肝胰臟組織中提取總RNA，經(jīng)超微量分光光度計（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和完整度后，用PrimeScriptTMRT 試劑盒（日本TaKaRa公司）合成cDNA，待用。根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒和3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒（日本TaKaRa公司）操作說明，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成各自第1 鏈cDNA，作為后續(xù)cDNA 末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）的模板。

1.2.2 NUCB2 基因的完整cDNA 克隆

根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.gov/pmc）中已知的斑馬魚NUCB2（NM_201493.1）序列，由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計同源引物NUCB2-F和NUCB2-R（表1），擴增胭脂魚NUCB2 的部分序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收純化DNA并測序。根據(jù)已測序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計5′和3′的RACE 引物NUCB2-5R 和NUCB2-3F（表1），依據(jù)上述方法中所得的cDNA 為模板，按照SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒和3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase 試劑盒操作說明完成后續(xù)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴增，獲得胭脂魚NUCB2的5′和3′序列。將RACE PCR擴增片段回收純化后，連接到pMD19-T 載體（日本TaKaRa公司）上，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技（北京）有限公司]中，然后涂布于含有氨芐青霉素、5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside,X-Gal）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG）[天根生化科技（北京）有限公司]的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基上，挑取白色陽性單菌落進(jìn)行測序。各序列經(jīng)驗證后，用Contig Express 軟件進(jìn)行拼接，得到胭脂魚NUCB2完整cDNA 序列。最后設(shè)計擴增完整開放閱讀框（open reading frame, ORF）的引物NUCB2-cF 和NUCB2-cR（表1）來驗證胭脂魚NUCB2基因cDNA的完整性。本試驗涉及的引物合成與核酸測序均由上海桑尼生物科技有限公司完成，所涉及的引物見表1。

1.2.3 NUCB2 序列分析

對于獲得的胭脂魚NUCB2完整cDNA序列，首先通過NCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）對比其核苷酸序列的一致性，再由NCBI ORF finder 在線分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測胭脂魚NUCB2 的完整開放閱讀框，找出起始密碼子和終止密碼子等基本生物學(xué)信息，并用NCBI BLASTP（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對比氨基酸一致性；運用SignalP 4.1 服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預(yù)測氨基酸序列的信號肽和前肽裂解位點；用ExPASy-ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）在線預(yù)測NUCB2 總分子量、理論等電點（isoelectric point, pI）、多肽疏水性和蛋白質(zhì)組成；用ProP 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP/）在線預(yù)測是否存在前肽裂解位點；運用Clustal X和DNAman軟件對序列進(jìn)行多重比對，使用MEGA 5.0 軟件的鄰接（neighbor joining,NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR

按照1.2.1 節(jié)的方法提取胭脂魚肝胰臟和腦組織總RNA，根據(jù)TransScript All-in-One cDNA supermix for qPCR 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明完成第1 鏈cDNA 反轉(zhuǎn)錄，用GoTaq qPCR Master Mix（美國Promega 公司）完成后續(xù)qPCR試驗。根據(jù)序列同源性，選擇18S作為參考基因，相關(guān)引物見表1。使用熒光定量PCR儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]進(jìn)行擴增反應(yīng)。每個組織均重復(fù)試驗3 次，基因的mRNA 相對表達(dá)量應(yīng)用2－ΔΔCT法進(jìn)行分析計算。

表1 引物序列及作用Table 1 Primer sequences and function

1.2.5 免疫組織化學(xué)分析

將肝胰臟組織切成5 μm的薄片，由武漢塞維爾生物科技有限公司完成。將胭脂魚腦組織塊從30%蔗糖中撈出，用0.01 mol/L 磷酸緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）沖洗以去除多余液體，然后放在濾紙上吸干水分，腹面向上，進(jìn)行間腦修整，把修整后的間腦平整地放在含已經(jīng)凍凝的OCT包埋劑（聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物）托盤上，滴加OCT，以覆蓋整個組織為準(zhǔn)，再放入CMl900恒溫冷凍切片機（德國Leica公司）操作臺上冷凍15 min；然后將放有組織塊的托盤放在冷凍探頭上，調(diào)整角度，對腦組織進(jìn)行勻速冠狀切片，厚度為40 μm；用勾線筆輕挑起切片并放入盛有冷的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）的6 孔板中，平衡30 min 后放入4 ℃冰箱中保存，1個月內(nèi)分析完成。

將肝胰臟組織切片用梯度乙醇脫蠟、復(fù)水后，放入含有0.1 mol/L、pH 6.0 的檸檬酸修復(fù)液的盒中（修復(fù)液沒過切片），然后放入微波爐中以100 W功率保持修復(fù)液微沸15 min，充分修復(fù)后，取出切片，自然冷卻20～30 min至室溫，待用。用鈍性柔和的小鉤（自制針灸針）從6 孔板中撈取5 個腦冰凍切片，輕放入24 孔晶體板的一個小孔內(nèi)，每孔加0.01 mol/L PBS 500 μL，浸泡5 min，然后依次轉(zhuǎn)入另外3孔，洗滌3 次。分別向腦組織和肝胰臟組織切片上滴加1%辛基酚聚氧乙烯醚（Triton）和10%山羊血清，孵育20 min 后，棄血清，滴加Nesfatin-1（美國R&D 公司）一抗（1∶100），置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，棄一抗，用PBS 洗5 次，每次5 min，然后滴加0.3%Triton-Alexa Fluor?488 驢抗山羊IgG（H＋L）（英國Abcam 公司）二抗（1∶200），于37 ℃避光孵育2 h后，避光洗5次，每次5 min。用丙三醇溶液進(jìn)行封片，在相同的電壓和激光強度下，參照BERNIER等[19]的方法對胭脂魚間腦核團(tuán)在FV10-ASW2.0 激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下進(jìn)行定位觀察并拍照；陰性對照分別是與一抗同源的IgG，熒光標(biāo)志物對照是PBS加二抗。通過預(yù)吸收法[20]進(jìn)行Nesfatin-1抗體特異性試驗。根據(jù)克隆的中國胭脂魚Nesfatin-1 的基因序列（GenBank 登錄號：MK962319），設(shè)計特異性引物來擴增目的基因序列（編碼Val24—Leu105，N-末端），用雙酶切法將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體PET32a 上，將重組載體命名為PET32a-Nesfatin-1，進(jìn)而轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Rostta（DE3）中進(jìn)行蛋白表達(dá)，并利用鎳柱進(jìn)行蛋白純化，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDA-PAGE）進(jìn)行鑒定。最后，以驗證后的胭脂魚Nesfatin-1蛋白與一抗Nesfantin-1進(jìn)行孵育、吸收，其被完全吸收的質(zhì)量濃度為38.2 mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。mRNA表達(dá)量以18S為內(nèi)參基因，結(jié)果為相對表達(dá)量。用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對Nesfatin-1 在3 齡和6 齡胭脂魚腦和肝胰臟內(nèi)的相對表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 表示差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中國胭脂魚NUCB2 基因全長序列分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

由NCBI ORF finder 在線分析工具預(yù)測得到：NUCB2 cDNA 全長2 090 bp，由長99 bp 的5′非翻譯區(qū)、1 449 bp 的開放閱讀框和542 bp 的3′非翻譯區(qū)組成，其中，3′非翻譯區(qū)還含有典型的AATAAA加尾信號。該蛋白由482 個氨基酸殘基編碼組成。用SignalP 4.1 服務(wù)器預(yù)測發(fā)現(xiàn)，NUCB2 有一個由23 個氨基酸組成的信號肽區(qū)（圖1）。用ExPASy-ProtParam 工具預(yù)測表明，NUCB2 分子量為56 632.07，理論等電點（pI）為4.96，親水性平均值為－1.141（小于0），說明其為親水蛋白。NUCB2蛋白組成中谷氨酸（Glu,E）最多，占13.7%，其次是亮氨酸（Leu, L），占10.0%，未見吡咯賴氨酸（Pyl,O）和硒半胱氨酸（Sec,U）。用ProP 1.0預(yù)測的結(jié)果顯示，賴氨酸（Lys,K）106-精氨酸（Arg,R）107和賴氨酸（Lys, K）179-精氨酸（Arg, R）180 可能是2 個潛在的前肽裂解位點，它們將除信號肽區(qū)外的NUCB2區(qū)域分割成長度為82個氨基酸的Nesfatin-1（24～105）、71 個氨基酸的Nesfatin-2（108～178）和302 個氨基酸的Nesfatin-3（181～482）3 個功能區(qū)域。

圖1 中國胭脂魚NUCB2的核苷酸和氨基酸序列分析Fig.1 Nucleic acid and amino acid sequence analysis of NUCB2 in Myxocyprinus asiaticus

2.2 NUCB2 同源性比對分析

多重序列比對結(jié)果（圖2）顯示，胭脂魚NUCB2和其他物種NUCB2 序列均含有20～35 個氨基酸序列的信號肽區(qū)域，均有2 個前肽裂解位點將其后序列分割成Nesfatin-1、Nesfatin-2 和Nesfatin-3 3個結(jié)構(gòu)域。在這3個結(jié)構(gòu)域中，長度為82個氨基酸的Nesfatin-1 在第37—49、77—79 號位點連續(xù)不保守；在Nesfatin-2 中，魚類和哺乳類的氨基酸比其他2 個區(qū)域更為保守，但哺乳類在第17、18 號位點氨基酸缺失，導(dǎo)致這一區(qū)域的魚類均有71 個氨基酸，而哺乳類的氨基酸只有69個；Nesfatin-3是3個結(jié)構(gòu)域中氨基酸數(shù)量最多且差異最大的，從405 號位點以后氨基酸序列不一致，到410 號位點后在哺乳類中均出現(xiàn)一段無氨基酸的對比空白（以人序列為參考）。

圖2 中國胭脂魚NUCB2氨基酸序列同源性比對Fig.2 Homology alignment of NUCB2 amino acid sequences in M.asiaticus

2.3 NUCB2 進(jìn)化樹分析

選取NCBI中已知的NUCB2氨基酸序列，利用MEGA 5.0 鄰接法（NJ 法）與胭脂魚NUCB2 推測的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，鳥類和哺乳類聚為一支，魚類中同屬鱸形目的羅非魚（Oreochromis niloticus）和青鳉（Oryzias latipes）聚為一支，胭脂魚NUCB2 先與斑馬魚（D.rerio）聚為一小支，再與同為鯉形目的白魚（Anabarilius grahami）、重口裂腹魚（Schizothorax davidi）和銀鯽（Carassius gibelio）聚為一大支（圖3）。

圖3 基于不同物種NUCB2氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on multiple alignments of NUCB2 amino acid sequences from various species

2.4 Nesfatin-1在胭脂魚腦和肝胰臟中的差異表達(dá)

由圖4 可見：在胭脂魚3 齡和6 齡2 個階段，Nesfatin-1在腦中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均極顯著低于在肝胰臟中的表達(dá)（P＜0.01)，而Nesfatin-1 在肝胰臟或腦中的轉(zhuǎn)錄未表現(xiàn)出明顯的年齡差異（P＞0.05)。以原核表達(dá)的胭脂魚Nesfatin-1蛋白為抗原，經(jīng)SDSPAGE鑒定表明，其抗體具有特異性（圖5）。免疫熒光結(jié)果（圖6）顯示：Nesfatin-1 蛋白表達(dá)在3 齡和6齡胭脂魚的肝胰臟中均呈強陽性反應(yīng)（圖6A），而在間腦內(nèi)的幾個核團(tuán)區(qū)均呈弱陽性反應(yīng)（圖6C）；在肝胰臟中，Nesfatin-1主要由米粒狀的胰腺細(xì)胞分泌，而在肝細(xì)胞中未見有陽性反應(yīng)（圖6B）；在控制攝食區(qū)的間腦中，在結(jié)節(jié)外側(cè)核、室周前核和室前核的少數(shù)大神經(jīng)元細(xì)胞中有Nesfatin-1 分泌，而在小神經(jīng)元細(xì)胞中未見有陽性反應(yīng)（圖6C和圖6D）。

圖4 Nesfatin-1 mRNA在2個發(fā)育期胭脂魚間腦和肝胰臟中的相對表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of Nesfatin-1 mRNA in the diencephalon and hepatopancreas of two developmental stages of M.asiaticus

圖5 胭脂魚Nesfatin-1原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.5 SDS-PAGE identification of prokaryotic expression protein Nesfatin-1 of M.asiaticus

圖6 Nesfatin-1在中國胭脂魚間腦及肝胰臟中的分布Fig.6 Distribution of Nesfatin-1 in diencephalon and hepatopancreas of M.asiaticus

3 討論

本研究克隆了中國胭脂魚NUCB2 基因的完整cDNA序列（MK962319）。通過核酸序列比對發(fā)現(xiàn)，胭脂魚NUCB2 的核酸序列與銀鯽（C. gibelio）、斑馬魚（D.rerio）、重口裂腹魚（S.davidi）的一致性分別高達(dá)88.40%、87.58%和85.50%，與鳥類和哺乳類相似度較低。氨基酸一致性對比得出，胭脂魚NCUB2 與斑馬魚的一致性高達(dá)85.69%，與重口裂腹魚和銀鯽的一致性分別為85.28%和83.88%。從系統(tǒng)發(fā)育樹也可以看出，胭脂魚與鯉形目魚類聚在一起，在鯉形目中NUCB2 核酸和氨基酸具有高保守性，推測其生物學(xué)功能在鯉形目中也高度保守。

胭脂魚NUCB2 的氨基酸序列中有2 個前肽裂解位點和1個信號肽，將整個基因分成4個區(qū)域，這與已知的其他脊椎動物的NUCB2結(jié)構(gòu)相同。胭脂魚NUCB2在進(jìn)化樹中與哺乳類和鳥類不聚集，但氨基酸多重序列比對結(jié)果顯示，它們在Nesfatin-1 區(qū)域都有82個氨基酸，且在Nesfatin-124－53（M30）核心功能區(qū)域[2]中，人類、牛（Bos taurus）、小鼠等哺乳動物和鳥類M30 區(qū)域僅在Nesfatin-135和Nesfatin-1392個位點中度保守，在Nesfatin-145位點不保守，其余位點均高度保守[20-23]，支持了NUCB2的M30區(qū)域在脊椎動物中高度保守，且可能存在諸多相似生理功能的觀點。在魚類中，鯉形目魚類的M30區(qū)域完全一致，但與鱸形目存在7 個不保守位點和3 個中度保守位點。M30 區(qū)域在哺乳類和魚類中氨基酸序列的各自保守性和差異性，說明Nesfatin-1 在哺乳類和魚類中的功能存在共性，也存在一定的物種特異性。

上述基因結(jié)構(gòu)分析證明，Nesfatin-1 的攝食抑制功能具有明顯的物種、組織和時間特異性。自O(shè)H-I 等[1]第一次發(fā)現(xiàn)腦注射Nesfatin-1 對鼠攝食的抑制作用后，隨著對Nesfatin-1 生理功能的深入探究，發(fā)現(xiàn)其在多種動物的中樞器官和外周器官中廣泛表達(dá)，表明Nesfatin-1 可能具有除抑制攝食外的多種生物學(xué)功能[14,24-25]。如糖代謝調(diào)節(jié)功能，在雌鼠體外試驗中，隨著葡萄糖濃度升高，其胃細(xì)胞中Nesfatin-1 濃度升高[26]；在金魚腸細(xì)胞體外試驗中，隨著葡萄糖濃度上升，Nesfatin-1下調(diào)表達(dá)[15]。證明Nesfatin-1在脊椎動物糖代謝調(diào)節(jié)中具有明顯的物種和組織特異性。對大鼠禁食后再飼喂，Nesfatin-1在其腦組織中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的先降后升變化，而在肝臟中的表達(dá)則明顯上升[27]；對金魚禁食后發(fā)現(xiàn)，其腦部Nesfatin-1表達(dá)下降，但在肝臟中Nesfatin-1則呈顯著上調(diào)表達(dá)[3]，顯示Nesfatin-1 的抑制攝食功能主要依賴于中樞調(diào)節(jié)，而肝臟則可能是對外源饑餓的條件刺激進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)的主要器官，即Nesfatin-1的代謝調(diào)節(jié)具有明顯的組織特異性。同時，本研究結(jié)果也證實，Nesfatin-1在胭脂魚腦和肝胰臟中存在明顯的時空表達(dá)差異。

有研究發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1與性腺發(fā)育相關(guān)，特別是對啟動初情期的調(diào)控有一定的作用，如在初情期雌性小鼠的卵巢和卵泡中檢測到Nesfatin-1蛋白的表達(dá)，在初情期雌性大鼠（Rattus norvegicus）中，Nesfatin-1在下丘腦上調(diào)表達(dá)[12]，證明Nesfatin-1對鼠初情期性腺發(fā)育有促進(jìn)作用。然而，對金魚和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）腹腔注射Nesfatin-1，顯著降低了其性激素的分泌[25,28]，表明在初情期魚類中外周性Nesfatin-1 起主要作用，負(fù)責(zé)此階段性腺發(fā)育過程中的能量累積，并對中樞性Nesfatin-1 促性腺發(fā)育功能起一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。本研究中，Nesfantin-1在初情期（6齡）和初情期前期（3齡）胭脂魚體內(nèi)表達(dá)均是外周性高于中樞性，與上述結(jié)果類似。此外，Nesfatin-1在快速生長期（初情前期和初情期）胭脂魚的胰腺細(xì)胞中大量分泌，發(fā)揮重要的刺激代謝的作用，可能是為了滿足快速生長期大量的能量累積需求；而其在間腦中的分泌位置比較廣泛，且表達(dá)量比較低，說明此階段中樞性Nesfatin-1 的功能也比較復(fù)雜，其抑食作用和促生殖作用可能由不同的腦功能區(qū)進(jìn)行控制，其準(zhǔn)確的功能定位有待深入探究。

在脊椎動物中未見對Nesfatin-2 和Nesfatin-3特定功能的研究。本試驗中多重序列比對結(jié)果顯示，Nesfatin-2 在脊椎動物中的高保守性區(qū)域也是一段古老的區(qū)域，說明它在脊椎動物中的生物學(xué)功能也可能是保守的。而Nesfatin-3 在405 號位點前保守性較高，直到第410號位點，哺乳動物相較于魚類出現(xiàn)了一段氨基酸空白，這一段空白可能揭示了Nesfatin-3 在生物從低等進(jìn)化到高等的過程中，氨基酸數(shù)量開始減少，功能可能也隨之發(fā)生改變。

4 結(jié)論

本研究克隆了中國胭脂魚的NUCB2 基因的完整序列，并通過基因序列和氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)其核酸序列在魚類中高度保守，與羊膜動物的保守性較低，但其核心序列M30/Nesfatin-1 卻有高度保守性；另外，根據(jù)不同斷裂位點，分析得出Nesfatin-2和Nesfatin-3 2個肽段，其生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。同時發(fā)現(xiàn)，核心肽Nesfatin-1 在中國胭脂魚生長期和性成熟初期的中樞和外周組織中存在明顯的表達(dá)和分布差異，但時間差異不明顯，可能與生長期與性成熟初期均為胭脂魚大量攝食期有關(guān)，更科學(xué)的生長期劃分還需要以其他魚類為對象進(jìn)一步深入研究，以免造成長江胭脂魚資源損耗。