冬凌草甲素-介孔二氧化硅固體分散體的制備及體外性質評價

李欽，原永芳，楊剛（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 藥劑科，上海 200000）

冬凌草甲素（ORI）是從冬凌草或碎米亞等唇形科香茶菜屬植物中分離出的一種有活性的天然有機化合物。研究表明，ORI具有較強的抗腫瘤活性，同時還具有抗菌、殺蟲及消炎止痛等功效[1-3]。目前，上市的冬凌草制劑均為粗提取物制劑，即片劑和糖漿劑等口服劑型，其所含有效成分ORI的含量較低，如冬凌草甲素片劑中其含量僅為1.189%[4]，因ORI幾乎不溶于水，且溶出速率較慢，因此口服后其生物利用度較低。

藥物的溶出是吸收的前提，對于難溶性藥物，藥物的溶出速率常為其吸收的限速步驟[5]。改善藥物的體內吸收首先需要解決的就是提高藥物的溶出度。介孔二氧化硅（MSN）固體分散體作為一種新型載體，它可以使吸附的難溶性藥物的結晶狀態(tài)發(fā)生改變，防止難溶性藥物重結晶，從而提高水難溶性藥物的溶解度。本研究利用MSN為載體制備ORI-MSN固體分散體，希望在高載藥量的前提下，提高藥物的水溶性和溶出度，從而提高藥物的口服吸收效果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010AHT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；IKA RCT磁力攪拌器（德國 IKA公司）；RC-806 溶出度儀（天津因賽科技發(fā)展有限公司）；D8 ADVANCE X-射線衍射儀（德國布魯克公司）；DZF6050 真空干燥箱（上海博遠實業(yè)有限公司）；Q2000 差示掃描量熱儀（美國 TA 公司）。

1.2 試藥

ORI對照品（含量≥99%，批號：111721-201403，中國食品藥品檢定研究院）；ORI原料藥（含量≥98%，批號：E1526003，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；冬凌草片（規(guī)格：0.25 g/片，批號：180501，河南濟世藥業(yè)公司）；正硅酸乙酯（TEOS，批號：20200214，永華化學股份有限公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，批號：20180423，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈為色譜級；其余試劑為市售分析純。

2 方法

2.1 ORI 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件[6]色譜柱：Dikma Diamonsil Plus-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40）；流速：1 mL·min－1；進樣量：20 μL；柱溫：25℃；檢測波長：242 nm。

2.1.2 標準曲線制備 精密稱取 ORI 對照品適量溶于甲醇中，分別配制成質量濃度為 10、30、60、90、120 μg·mL－1的 ORI系列對照品溶液，進樣測定，記錄峰面積值A，以質量濃度C對峰面積A作線性回歸，得回歸方程。

2.1.3 精密度試驗 取10、60、120 μg·mL－13個質量濃度的ORI對照品溶液，在同一色譜條件下，分別在日內和日間重復測定5次，平行操作 5份，計算日內精密度和日間精密度。

2.1.4 回收試驗 取 10、60、120 μg·mL－13個質量濃度的ORI對照品溶液，加入空白MSN混懸液中，10 000 r·min－1離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，平行操作5份，取濾液進樣測定，計算回收率。

2.2 溶解度測定

在西林瓶中分別加入蒸餾水、0.2%十二烷基硫酸鈉（SDS）、0.2%吐溫-80、0.5%吐溫-80適量，分別加入過量ORI原料藥，封瓶口，25℃水浴振蕩 48 h，取樣，12 000 r·min－1離心 10 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液20 μL進樣測定，計算ORI在不同介質中的溶解度。

2.3 MSN 的制備 [7]

以 CTAB 作為膠束模板，于 150 mL 蒸餾水中溶解 0.5 g CTAB，配成澄清溶液。緩緩向此溶液中加入濃度為 2 mol·L－1的 NaOH 溶液6 mL，邊加邊攪拌，混勻后，水浴加熱至 60℃，維持恒溫，緩慢滴入 TEOS 6 mL，高速攪拌 2 h。將所得渾濁液離心，洗滌，然后將所得白色固體轉移至三口燒瓶中，并加入酸性乙醇溶液（乙醇-鹽酸 4∶1）150 mL，待其充分分散后，加熱至80℃回流 3 h 以便除去 CTAB，再次抽濾，并用蒸餾水和無水乙醇交替洗滌 3 次，于50℃真空干燥，即得MSN 載體粉末。

2.4 ORI-MSN的制備[8]

精密稱取適量ORI，用100 mL乙醇溶解，分別按照ORI與MSN質量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6和 1∶10的比例加入MSN 粉末，水浴超聲將載體完全分散，用磁力攪拌器攪拌 4 h，以達到吸附平衡，置于50℃條件下旋轉蒸發(fā)去除溶劑，得到顏色均一的固體粉末。隨后將所得粉末置于真空干燥箱中干燥 24 h（25℃），研細，過80目篩，即得ORI-MSN。

2.5 載藥量測定

精密稱取適量ORI-MSN分散于氯仿中，水浴超聲10 min后用氯仿定容至10 mL，10 000 r·min－1離心 5 min，取上清液用甲醇稀釋后采用HPLC 進行檢測，載藥量的計算公式如下：載藥量（%）＝WORI/WORI-MSN×100%，式中，WORI表示ORI-MSN中ORI的質量，WORI-MSN表示負載ORI的MSN的質量。

2.6 透射掃描電鏡（TEM）

利用透射電鏡觀察 ORI-MSN的外觀形態(tài)。將分散有ORI-MSN的去離子水，取適量滴加至銅網(wǎng)上，自然干燥，等待約20 min即可形成薄膜，再在薄膜上滴加2%磷鎢酸負染10 min，用濾紙小心吸除銅網(wǎng)邊緣多余的液體，自然干燥后置于透射電鏡下觀察。

2.7 物相鑒別

采用Cu-Kα射線作為X-射線，管電壓40 kV，管電流20 mA，衍射角（2θ）的測定范圍為0～60°，步長為 0.02°。分別對ORI、MSN、ORI-MSN以及物理混合物進行XRD分析。

取 ORI、MSN、ORI-MSN 以及物理混合物適量（2～6 mg），分別裝入鋁坩中進行差示掃描量熱（DSC）分析，以空鋁坩鍋為參比，掃描范圍10～300℃，升溫速度為10℃·min－1，氮氣流速為60 mL·min－1。

2.8 穩(wěn)定性考察

在溫度（40±2）℃和相對濕度（75±5）%的條件下，將 ORI-MSN進行加速試驗，分別于1、2、3、6個月末取樣，比較存放前后 ORI含量和溶出度變化。

2.9 ORI-MSN 的體外溶出試驗

2.9.1 ORI-MSN 在不同溶出介質中的溶出度按照溶出度測定法（《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩC漿法），取 ORI-MSN適量，分別以 900 mL蒸餾水、0.1 mol·L－1HCl、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液為溶出介質，37℃，轉速 50 r·min－1，于 5、10、15、20、30、45、60、90、120 min各取樣 5 mL，并及時補充相同溫度的溶出介質 5 mL，取出的樣品用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣測定，計算在不同時間得到的ORI的累積溶出百分率，并繪制溶出曲線。

2.9.2 溶出度比較 取 ORI 原料藥、市售制劑冬凌草片及 ORI-MSN 適量，按照溶出度測定法（《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩC第一法），以 900 mL 蒸餾水為溶出介質，按“2.9.1”項下方法操作，進樣測定，計算不同時間藥物的累積溶出百分率，繪制溶出曲線。

3 結果

3.1 方法學考察

回歸方程為A＝18.97C－0.1631（r＝0.9999），ORI在10～120 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。同時，日內RSD和日間RSD分別為0.19% 和0.24%，平均回收率為（99.7±0.17）%，表明該方法適用于 ORI 的含量測定。

3.2 ORI 在不同溶劑中的溶解度

由表1可知，在所考察的溶劑中，ORI原料藥在蒸餾水中的溶解度最低，在0.2%SDS中的溶解度最好。

表1 ORI 在各種溶劑中的溶解度(n＝3)Tab 1 Solubility of ORI in various solvents (n＝3)

3.3 不同藥載比對載藥量的影響

不同藥載比所得載藥量的結果見圖1，藥載比例與介孔孔道的載藥量成正比。當藥載比例大于1∶3時，載藥量逐漸接近極值，此時介孔孔道的吸附量接近飽和。繼續(xù)提高藥物比例，藥物裝載量基本不變。因此選擇藥載比例為1∶3，得到的載藥量為（26.47±1.18）%。

圖1 不同藥物 / 載體比例的載藥量曲線（n＝3）Fig 1 Curve of drug loading with different ratios of drugs and carriers（n＝3）

3.4 外觀形態(tài)

圖2為ORI-MSN的透射電鏡圖。由圖可知，ORI-MSN形態(tài)完整，均呈橢球形，粒徑均一，尺寸約為100 nm，且有規(guī)整的孔道結構。

圖2 ORI-MSN透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron microscopy image of ORI-MSN

3.5 物相分析

XRD結果如圖3所示，ORI在2θ為4.337°、9.183°、19.203°、43.827°有尖銳的特征峰，表明 ORI主要以晶體形式存在，晶體衍射峰強度較大；ORI-MSN中，ORI的晶體衍射峰消失，表現(xiàn)為無定形特征；而在物理混合物仍然出現(xiàn) ORI的晶體衍射峰，這一現(xiàn)象表明藥物與載體之間未發(fā)生分子間的作用。

圖3 ORI 原料藥、MSN、物理混合物及 ORI-MSN 的 XRD 譜圖Fig 3 XRD of ORI，MSN，physical mixture，and ORI-MSN

DSC結果如圖4所示，ORI在 257.7℃有特征吸熱峰，物理混合物中也存在ORI的特征吸熱峰。在制備成ORI-MSN后，ORI在 257.7℃特征吸熱峰消失，說明藥物與載體之間發(fā)生了反應，MSN 的小孔道妨礙了 ORI 形成結晶，在MSN中ORI只能以非晶體的狀態(tài)存，進一步證實了XRD的結果。

圖4 ORI 原料藥、MSN、物理混合物及 ORI-MSN 的 DSC 譜圖Fig 4 DSC of ORI，MSN，physical mixture and ORI-MSN

3.6 穩(wěn)定性評價

由表2可得，ORI原料藥在同一溫濕度條件的環(huán)境下加速試驗6個月后，藥物含量幾乎沒有變化；ORI-MSN中的藥物含量有所下降，但是仍在96%以上，說明ORI-MSN的穩(wěn)定性較好。造成ORI-MSN中藥物含量降低的原因可能是由于ORI負載于MSN 后，形成的物理結構在熱力學上是不穩(wěn)定的無定形或部分無定形狀態(tài)，其受熱后會轉化為更穩(wěn)定的藥物結晶，所以藥物含量有所降低[8-9]。而ORI原料藥以淡黃色針狀結晶存在，因此穩(wěn)定性更好。此外，ORI原料藥和ORI-MSN 的累積溶出在放置 6個月后，并無明顯變化。

表2 穩(wěn)定性研究(n＝3)Tab 2 Study of stability (n＝3)

3.7 體外釋藥曲線

由圖5可知，在不同溶出介質中，ORIMSNs的溶出度大小順序依次為：0.1 mol·L－1HCl＞蒸餾水＞pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，即溶出介質pH越小，ORI-MSNs的溶出度越大。故后續(xù)試驗的溶出介質選擇pH 6.8的磷酸鹽緩沖液。

圖5 ORI-MSN 在不同溶出介質中的體外釋放曲線（n＝3）Fig 5 In vitro release curve of ORI-MSN in different dissolution media（n＝3）

對比市售制劑冬凌草片，ORI原料藥，以及ORI-MSN的溶出度可知（見圖6），ORI原料藥溶出度較小，溶出速率也較慢，累積溶出度小于30%；冬凌草片在120 min時的累積溶出度為65.43%；ORI-MSN溶出度最大，在60 min后累積溶出在80%以上。上述結果表明，制成ORIMSN后顯著提高了ORI的溶出度。

圖6 ORI、市售制劑和 ORI-MSN 的體外釋放曲線（n＝3）Fig 6 In vitro release curve of ORI，commercial product and ORIMSN（n＝3）

4 討論

藥物生物利用度受藥物的溶解性能影響較大，在胃腸道溶出較慢，致使口服生物利用度低。改善難溶性藥物的溶出方式有很多[11]，其中采用固體分散技術，將藥物高度分散于惰性的載體中，形成藥物的固態(tài)分散體系，可顯著增加難溶性藥物的溶出速率[12]。近年來，MSN作為藥物固體分散體載體材料，在制藥領域中廣泛使用。MSN內部的孔道大大增加了比表面積，能吸附大量藥物并使藥物均勻分散，降低顆粒間的吸附作用，從而避免一些細粉狀藥物的附聚與結塊，有利于藥物粒子與溶解介質充分接觸，促進藥物的溶解與釋放[13]。MSN孔道還抑制了難溶性藥物形成結晶，在MSN中難溶性藥物只能以無定形或微晶狀態(tài)存在[14]，而無定形或微晶狀態(tài)會增加藥物溶出度[15]。同時，MSN的孔道由于增加了比表面積，促進藥物的溶解與釋放，進而提高了生物利用度[16-17]。此外，MSN的使用還可起到抗老化作用，因其提高了固體分散體的穩(wěn)定性[18]。

本研究成功將ORI負載于MSN中，ORI在與MSN 結合后發(fā)生了晶型轉變，藥物以無定形存在于MSN孔道中，并能夠保持相對穩(wěn)定。體外溶出試驗結果表明，對于難溶性的ORI應用MSN作為載體后，顯著提高了ORI的溶出速率和累積溶出百分率。該研究為ORI的臨床應用帶來更廣泛的可行性，也說明MSN可以改善難溶性中藥成分的溶出度。

雖然MSN作為難溶性藥物的載體有很多優(yōu)點，但還缺少其他相關研究，包括進入人體后發(fā)生的變化和體內代謝過程，因此仍需謹慎評估其安全性并對比其他給藥載體，因此MSN載體技術真正應用于臨床還需不斷的探索和努力。