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    四物湯防治動脈粥樣硬化分子機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究及實驗驗證

    2021-11-01 05:33:08張盟孫麗萍高文雅趙丕文北京中醫(yī)藥大學生命科學學院北京0488北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院北京0488
    中南藥學 2021年10期
    關(guān)鍵詞:四物湯靶點化合物

    張盟,孫麗萍,高文雅,趙丕文*(. 北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院,北京 0488;. 北京中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院,北京 0488)

    根據(jù)世界衛(wèi)生組織的相關(guān)統(tǒng)計,心血管疾?。╟ardiovascular diseases,CVDs)在近幾十年內(nèi)已發(fā)展成為導致人類死亡的主要原因之一。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心肌梗死及腦卒中等心血管疾病的根本原因,典型特征是動脈壁上的AS斑塊,在冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)、腦、外周動脈有不同程度的臨床表現(xiàn),是心血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)[1]。

    四物湯由熟地、當歸、白芍、川芎四味中藥組成[2]。中醫(yī)學既往并無AS對應病名記載,依據(jù)致病特點及臨床表現(xiàn)。AS歸屬于中醫(yī)學“脈痹、眩暈、胸痹心痛、中風、頭痛”等病癥范疇,主要證候為痰瘀互結(jié)證、氣虛血瘀證等,針對不同證型AS的主要治療藥物中,多數(shù)都包括了四物湯中的幾味藥物[3]。

    為了能夠更加深入、全面地探討四物湯防治AS作用的分子機制,本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫挖掘,對其可能發(fā)揮作用的途徑和靶點進行探究;在此基礎(chǔ)上,應用血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)進行四物湯防治AS相關(guān)分子機制的體外實驗驗證。

    1 方法

    1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理分析方法

    1.1.1 四物湯中主要活性化合物的篩選與對應靶點的收集 采用TCMSP平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以類藥性(drug-like property,DL)>0.18,口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%為條件篩選主要活性化合物[4]。在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站中獲取目標化合物SDF結(jié)構(gòu)圖,將該結(jié)構(gòu)圖導入Swisstarget平臺(http://swisstargetprediction.ch/)[5-6],對目標化合物相關(guān)靶點進行預測,以可能性Probability>0.2篩選靶點,通過Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“四物湯-單味藥-化合物-靶點”的網(wǎng)絡(luò)[7]。

    1.1.2 AS相關(guān)靶點的收集 以AS為關(guān)鍵詞,在DrugBank(https://www.drugbank.com/)與OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)中搜索該疾病相關(guān)靶點。在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索AS疾病相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)集;篩選目標數(shù)據(jù)集所測樣本有>10個樣本數(shù)量的AS斑塊組織,同時具有>10個樣本數(shù)量的正常血管組織作為對照。從選定的基因表達數(shù)據(jù)集中使用GEO2R工具分析,得到各基因的表達水平情況,生成樣本的基因火山圖;以P-value<0.05和∣log2(fold change)∣>1為標準篩選具有統(tǒng)計學意義的差異表達基因(differential expressed genes,DEGs),選取上升和下降最顯著的前20個基因繪制熱圖。

    1.1.3 四物湯防治AS的靶點收集 將“1.1.2”項下獲得的AS相關(guān)基因取合集,與“1.1.1”項下獲四物湯主要活性化合物對應靶點同步導入Cytoscape 3.7.0中,取兩部分的交集,預測四物湯防治AS的靶點,并構(gòu)建“化合物-靶點”的網(wǎng)絡(luò)。

    1.1.4 GO與KEGG通路富集分析 將“1.1.3”中預測的四物湯防治AS的靶點導入David數(shù)據(jù)庫,進行基因本體論(GO)富集分析,分析四物湯對細胞生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(MF)三個分類的作用[8];對靶點進行京都基因百科全書(KEGG)富集分析,以P-value<0.05為標準進行篩選。

    1.1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將得到的四物湯防治AS的靶點輸入String數(shù)據(jù)庫(https://stringdb.org),檢索“互作基因/蛋白質(zhì)”,限定研究物種為智人,進行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)的構(gòu)建,以PPI評分閾值>0.4進行預測[9]。導入Cytoscape 3.8.0軟件對PPI結(jié)果進行可視化。

    1.2 體外實驗方法

    1.2.1 實驗材料 大鼠胸大動脈平滑肌A7R5細胞(上海中科院細胞庫);熟地、當歸、白芍、川芎(經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉啟福教授鑒定為正品,北京同仁堂藥店);氧化低密度脂蛋白(廣東奕源生物);DMEM 細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰酶、青/鏈霉素(賽默飛世爾生物化學制品);一氧化氮試劑盒(北京百瑞極生物);TRITC熒光標記二抗(中杉金橋);子α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、ERα抗體(Abcam);eNOS抗體、GADPH抗體、山羊抗兔二抗(proteintech)。

    1.2.2 制備四物湯凍干粉 精密稱取熟地30 g,當歸18 g,白芍18 g,川芎12 g(共78 g藥物),用8倍體積水浸泡30 min,煎煮2次,每次1 h,過濾后合并濾液,將溶液濃縮至約200 mL,12 000 r·min-1離心10 min后取上清液,置于圓底燒瓶裝至凍干機,以-80℃凍干過夜。制得中藥凍干粉40 g,每1 g凍干粉含有四物湯生藥1.95 g。

    1.2.3 VSMCs培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清與1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2,100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A7R5細胞。

    1.2.4 VSMCs細胞的鑒定 免疫熒光檢測平滑肌細胞特異性標記分子α-SMA;將正常生長至70%密度以上的VSMCs細胞用4%多聚甲醛固定30 min,封閉后使用α-SMA抗體進行4℃孵育過夜;第二日,使用熒光標記二抗在室溫下避光孵育1 h,激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV3000,Tokyo,Japan)下獲取圖像。

    1.2.5 細胞增殖能力測定 將VSMCs以每孔8×104個細胞的密度接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后進行處理;在四物湯對VSMCs增殖能力的影響實驗中,設(shè)置空白對照組與四物湯組(培養(yǎng)基稀釋藥物質(zhì)量濃度分別為0、25、50、75、100、250、500、750、1000、1250、1500 μg·mL-1),空白對照組僅做基礎(chǔ)培養(yǎng)。在四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs增殖能力影響實驗中,設(shè)置空白對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組和四物湯高劑量組;根據(jù)文獻中所用劑量[10],模型組與四物湯組加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)100 μg·mL-1進行誘導增殖,構(gòu)建細胞AS模型,四物湯組同時加入100、500、1000 μg·mL-1四物湯,處理24 h后,加入CCK8試劑,37℃孵育2~3 h,使用酶標儀在450 nm處測定吸光度值,計算細胞增殖率。

    1.2.6 一氧化氮含量測定 VSMCs按每孔3×105個細胞的密度接種至6孔板,培養(yǎng)24 h后進行處理,分組設(shè)置與處理同“1.2.5”中細胞增殖實驗。37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后,收集細胞上清液,4℃,3000 r·min-1離心15 min去除上清中漂浮細胞。按一氧化氮(NO)檢測試劑盒說明書,制作NO含量標準曲線,根據(jù)吸光度值計算細胞上清中NO含量。

    1.2.7 Western blot法檢測蛋白表達量 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果,選擇四物湯防治AS的關(guān)鍵靶點進行實驗驗證。VSMCs按每孔6×105個細胞的密度接種至T25培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)24 h后進行處理,分組設(shè)置與處理同“1.2.5”項下,給藥48 h后,低溫下提取細胞總蛋白。蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上進行電泳,后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)到PVDF膜,封閉后置于一抗中在4℃冰箱孵育過夜,將二抗在室溫搖床上孵育1 h,于凝膠成像儀(BIORAD化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng))成像。

    1.2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,實驗數(shù)據(jù)分析均采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果

    2.1.1 四物湯中主要活性化合物 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到四物湯中共含有475個化合物,包括白芍85個、川芎189個、熟地76個、當歸125個,排除重復化合物得到438個,根據(jù)“1.1.1”項下所述OB與DL值篩選得到20個主要活性化合物(見表1)。

    表1 四物湯中藥物所含主要活性化合物Tab 1 Main active compounds in SWT

    2.1.2 四物湯中主要活性化合物對應靶點 在TCMSP與Swiss target數(shù)據(jù)庫中分別獲取20個化合物潛在作用靶點,TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得14個化合物對應的192個潛在靶點,Swiss target數(shù)據(jù)庫中獲得14個化合物對應的143個潛在靶點,有6個化合物在兩個數(shù)據(jù)庫中均未獲得預測靶點;所有潛在靶點去掉重復項后取合集,共得到203個潛在作用靶點。主要活性化合物與預測靶點關(guān)系網(wǎng)(見圖1),其中黃色為中藥名稱縮寫,橙色為主要活性化合物,綠色為預測靶點。

    圖1 主要活性化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Major active compounds-target network

    2.1.3 AS疾病相關(guān)基因 以AS為關(guān)鍵詞,在OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫中進行檢索查詢,分別得到270個、62個靶點。在GEO數(shù)據(jù)庫中選取GSE100927數(shù)據(jù)集,其中包括69個AS斑塊樣本和35個正常動脈組織的基因組信息,以鑒定AS和健康動脈外周動脈之間的DEGs[11]。使用GEO2R工具進行基因表達差異分析,共得到54 674個基因的表達信息,其中表達上調(diào)基因27 237個,下調(diào)基因27 437個,生成樣本的基因火山圖見圖2:零點右側(cè)(log2FC>0)為表達水平上調(diào)基因,零點左側(cè)(log2FC<0)為表達水平下調(diào)基因,顯著上調(diào)的基因多于顯著下調(diào)的基因;紅色和綠色分別代表上調(diào)基因(log2FC>1)和下調(diào)基因(log2FC<1),即相比較于正常組織的表達水平,部分基因的表達水平高于或低于正常水平2倍,灰色表示差異不顯著。根據(jù)P<0.05和∣log2(fold change)∣>1標準篩選全部基因表達信息,共得到552個AS組織與正常動脈組織的DEGs。選取正常與AS動脈組織各20組樣本,與∣log2(fold change)∣>1的基因中上調(diào)和下調(diào)最顯著的前20個基因繪制熱圖(見圖3)。將上述DEGs與Drugbank和OMIM數(shù)據(jù)庫中篩選的AS相關(guān)基因取合集,去除重復項,得到848個AS相關(guān)的基因。

    圖2 GSE100927數(shù)據(jù)集中基因分布火山圖(P<0.05)Fig 2 Volcano map of gene distribution in GSE100927 dataset(P<0.05)

    圖3 GSE100927數(shù)據(jù)集中差異表達基因聚類熱圖Fig 3 Heat map clustering of DEGs in GSE100927 dataset

    2.1.4 四物湯防治AS的靶點 將所得四物湯主要活性化合物對應靶點與得到的AS相關(guān)基因取交集,得到四物湯防治AS的靶點共37個。山柰酚、兒茶酸、楊梅酮、川芎哚、β-谷甾醇、豆甾醇分別與22個、8個、8個、8個、7個、6個靶點相關(guān)。與四物湯主要活性化合物關(guān)系最密切的靶點是PTGS1、PTGS2、ALOX5、RXRA、F2和ESR1(見圖4)。

    圖4 預測靶點與對應的主要活性化合物Fig 4 The predicted targets and corresponding main active compounds

    2.1.5 GO及KEGG通路富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示,四物湯防治AS的靶點參與影響176個BP,19個CC與33個MF,選擇GO分析各部分前10條繪制柱狀圖(見圖5);其中四物湯對BP影響主要涉及炎癥反應、對血壓調(diào)節(jié)、對雌激素反應等方面;對CC影響主要涉及質(zhì)膜、細胞外空間和細胞外區(qū)域等方面;對MF影響主要涉及蛋白質(zhì)綁定、酶綁定、蛋白質(zhì)同源二聚化活動、鋅離子結(jié)合、血紅素結(jié)合等方面。KEGG富集分析結(jié)果顯示,四物湯防治AS的靶點共涉及到51條信號通路,將KEGG富集分析的前10條通路繪制成氣泡圖見圖6;P值從大到小在圖上顯示為氣泡顏色從綠色到紅色;氣泡面積大小與通路涉及的基因數(shù)量正相關(guān);橫軸表示該條通路涉及基因占總體輸入基因的比例。四物湯防治AS的靶點所參與的通路主要集中在腫瘤壞死因子(TNF)、NF-κB、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、乙型肝炎(HBV)等通路。

    圖5 預測靶點的GO功能富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of the predicted targets

    圖6 預測靶點的KEGG富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis of the predicted targets

    2.1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 PPI網(wǎng)絡(luò)共有37個節(jié)點和186個相互作用的邊(見圖7),網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(圓形)表示由基因編碼的蛋白質(zhì),邊線表示兩個節(jié)點間的相互作用。對于每對節(jié)點間的關(guān)聯(lián)強度的評價有多維度指標(如基因融合、共表達與大規(guī)模實驗的支持等),將多個維度指標計算整合形成綜合評分,可以提高對節(jié)點間關(guān)聯(lián)強度評價的可信度(在PPI網(wǎng)路圖中,邊線約寬,節(jié)點間關(guān)聯(lián)強度約高)[12]。從圖7中可以得出,根據(jù)Degree值排序,網(wǎng)絡(luò)中最重要的5個節(jié)點分別為IL-6、TNF、PTGS2、MMP9與NOS3等。

    圖7 預測靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 7 PPI network of the predicted targets

    IL-6、TNF、PTGS2與MMP9基因編碼產(chǎn)生蛋白均為可作為炎性標志物,提示炎癥水平。NOS3基因編碼產(chǎn)生蛋白是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS),可以調(diào)節(jié)血管張力和局部血流,抑制VSMCs細胞增殖以及調(diào)節(jié)白細胞-內(nèi)皮相互作用等多種作用[13];精氨酸在eNOS催化下合成NO,NO具有多種抗AS作用,包括抑制低密度脂蛋白氧化、防止白細胞黏附血管內(nèi)皮,抑制血管平滑肌細胞增殖等[14];并且NO還被認為是一種抗炎分子,其抗炎作用主要是通過抑制NF-κB 活性來抑制AS的形成[15]。根據(jù)綜合評分,在以NOS3為中心的PPI網(wǎng)絡(luò)中與NOS3節(jié)點關(guān)聯(lián)強度最高的節(jié)點為ESR1,編碼產(chǎn)生蛋白是雌激素受體α(ERα)(見圖8)。為了驗證四物湯對VSMCs更廣泛的抗AS作用,后續(xù)驗證實驗對四物湯處理的VSMCs進行NO水平檢測,并采用Western blot法對VSMCs的eNOS與ERα表達量進行檢測。

    圖8 以NOS3為中心的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 8 A NOS3-centric PPI network

    2.2 體外實驗結(jié)果

    2.2.1 VSMCs生長形態(tài)與表型的鑒定 光學顯微鏡下觀察顯示,VSMCs形狀為梭形,平行排列,細胞生長呈“谷峰狀”(見圖9)。免疫熒光實驗染色顯示,TRITC標記的α-SMA呈紅色,胞質(zhì)內(nèi)存在大量平行于細胞長軸的紅色細絲(見圖10),表明該細胞具有VSMCs的表型特征。

    圖9 光學顯微鏡下VSMCs形態(tài)與分布(20×)Fig 9 Morphology and distribution of VSMCs under light microscope(20×)

    圖10 α-SMA免疫熒光染色(100×)Fig 10 α-SMA immunofluorescence staining(100×)

    2.2.2 四物湯凍干粉對VSMCs增殖能力的影響通過CCK8法測試了不同質(zhì)量濃度的四物湯(25~1500 μg·mL-1)對VSMCs活力的影響,如圖11所示,四物湯作用24 h后,對細胞增殖率無明顯影響,推測在這一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)四物湯的處理對VSMCs生長無細胞毒性,故本實驗挑選其中具有一定質(zhì)量濃度差的高、中、低3個劑量(分別為1000、500、100 μg·mL-1)進行后續(xù)實驗。

    圖11 四物湯對VSMCs增殖率影響(±s,n=3)Fig 11 Effect of different concentrations of Siwu decoction on VSMCs proliferation rate(±s,n=3)

    2.2.3 四物湯凍干粉對ox-LDL誘導VSMCs增殖能力的影響 如圖12 所示,與空白對照組相比,模型組VSMCs的增殖率顯著提高(P<0.01);與模型組相比,四物湯組細胞增殖率均降低(P<0.05),對ox-LDL誘導的增殖有一定抑制作用,但三組間差異無統(tǒng)計學意義。

    圖12 四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs增殖率的影響(x± s,n=3)Fig 12 Effect of different concentrations of Siwu decoction on ox-LDLinduced VSMCs proliferation rate(x ±s,n=3)

    2.2.4 四物湯凍干粉對ox-LDL誘導VSMCs的NO水平的影響 如圖13所示,與空白對照組相比,ox-LDL處理的VSMCs的NO產(chǎn)生水平下降(P<0.05),而高劑量與中劑量的四物湯處理VSMCs,均可明顯提升ox-LDL誘導的NO水平的下降(P<0.01),并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

    圖13 四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs中NO水平的影響(±s,n=3)Fig 13 Effect of Siwu decoction on nitric oxide levels in ox-LDLinduced VSMCs(x ±s,n=3)

    2.2.5 四物湯凍干粉對ox-LDL誘導VSMCs的eNOS與ERα蛋白表達的影響 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果,為了進一步驗證四物湯對VSMCs作用的具體分子機制,通過Western blot法觀察四物湯對eNOS和ERα在VSMCs中表達量的影響。如圖14所示,與對照組相比,ox-LDL可以明顯降低ERα、eNOS的表達量(P<0.05),這一作用在加入四物湯的處理后被逆轉(zhuǎn),并且均在四物湯劑量為500 μg·mL-1組效果最為明顯。

    圖14 Western blot法檢測VSMCs的ERα、eNOS的表達水平(±s,n=3)Fig 14 Expression level of ERα and eNOS analyzed by Western blot(±s,n=3)

    3 討論

    藥用植物抗AS活性主要表現(xiàn)為抗炎、抗氧化、降壓、降脂、抗血栓等多種作用。此外,大多數(shù)藥用植物的特點是其多效抗AS作用。此外,藥用植物衍生的化合物具有相對安全、副作用少的特點,因此可作為抗AS的一類有效藥物[16]。本研究也證實了四物湯的主要活性化合物具有此類作用。

    3.1 四物湯防治AS可能涉及的主要活性化合物

    通過TCMSP和GEO數(shù)據(jù)庫獲得四物湯干預AS的37個靶點,靶點對應的四物湯中主要活性化合物按重要程度排序為:山柰酚、兒茶酸、楊梅酮、川芎哚、β-谷甾醇、豆甾醇。其中山柰酚是一種天然類黃酮,其抗炎、抗氧化和抗腫瘤的功效已被報道用于治療多種疾病[17];在血管內(nèi)皮細胞中,還可激活血紅素氧合酶1(HO-1)的表達,激活過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽 (GSH-Px)等,保護血管免受氧化應激和炎癥誘導的損傷[18]。兒茶素是常見于茶類中的一種黃酮類化合物,其攝入量與減少心血管疾病成正相關(guān)[19-21];兒茶素可激活eNOS酶產(chǎn)生NO,以改善血管內(nèi)皮功能障礙[22-23];并且兒茶素可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達,抑制凝血酶誘導的VSMCs的增殖[24]。楊梅酮具有良好的抗氧化及抗腫瘤等活性[25-27],并且對氧化應激誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡有保護作用[28]。川芎哚是中藥川芎、黨參中的活性物質(zhì)之一,川芎哚及其類似物具有一定程度的抗凝血、減少紅細胞聚集、抗血栓與改善血液流變學的作用[29-31]。β-谷甾醇存在于多種中藥的甾體類化合物,富含β-谷甾醇的藥物在巨噬細胞中通過影響NO與活性氧(ROS)明顯減少小鼠的主動脈根部AS病變面積,并且阻止人單核細胞THP-1與VSMCs的黏附[32]。

    3.2 四物湯防治AS預測靶點的富集分析

    對四物湯防治AS的靶點進行GO富集分析發(fā)現(xiàn),主要參與的BP為對炎癥反應、缺氧反應、血壓調(diào)節(jié)、雌激素反應、細胞因子分泌的正調(diào)控。眾多臨床與基礎(chǔ)實驗都已經(jīng)證實AS是一種慢性血管炎癥反應,而近年來的研究也進一步證實機體免疫細胞的反應是AS斑塊形成的第一步,更是動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定的主要原因之一[33];高血壓作為AS的重要風險因素,血壓升高狀態(tài)下對內(nèi)皮細胞損傷與促進VSMCs過度增殖在形成AS的過程中也是必不可少的[34];KEGG富集分析得到TNF、NF-κB、NAFLD、乙型肝炎、癌癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)等信號通路。對于AS進展過程中分泌的眾多細胞因子的調(diào)節(jié),也對AS的治療有非常重要的意義。細胞因子都是通過其所在信號通路來發(fā)揮作用[35],其中TNF-α是最重要的促炎癥因子之一,可以誘導ROS的產(chǎn)生,使內(nèi)皮功能出現(xiàn)障礙,并轉(zhuǎn)換VSMCs的細胞表型[36];同樣在一個炎性因子主導的通路中,NF-κB參與激活內(nèi)皮細胞黏附分子如E-選擇素、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等與單核細胞的黏附作用,并且轉(zhuǎn)換VSMCs表型,同時巨噬細胞的黏附增多,促進AS斑塊的發(fā)生[37]。

    3.3 四物湯防治AS預測靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

    在PPI網(wǎng)絡(luò)中,根據(jù)Degree值排序最重要的5個節(jié)點分別為IL-6、TNF、PTGS2、MMP9與NOS3等。除IL-6、TNF、PTGS2與MMP9均可編碼產(chǎn)生炎性標志物分子外;NOS3基因編碼產(chǎn)生的eNOS分子不僅有調(diào)節(jié)血管張力和局部血流等作用,其催化產(chǎn)生的NO可通過誘導和穩(wěn)定NF-κB的抑制因子IκB而抑制 NF-κB的激活,從而控制黏附分子與炎癥介質(zhì)的表達,對AS的病理發(fā)展起到抑制作用[38]。根據(jù)對蛋白互作強度的綜合評分(由基因融合、共表達與大規(guī)模實驗的支持等因素綜合計算),在以NOS3為中心的PPI網(wǎng)絡(luò)中與NOS3節(jié)點關(guān)聯(lián)強度最高的節(jié)點為ESR1(編碼產(chǎn)生ERα);雌激素可以一種ERα依賴的方式快速激活MAPK通路,進而激活eNOS;并且雌激素與雌激素受體(ERs)結(jié)合,通過刺激熱休克蛋白90(HSP90)和AKT/蛋白激酶B(PKB)依賴的機制激活eNOS[39]。

    3.4 四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs細胞的作用

    在動物模型和人類研究中,VSMCs的增殖導致血管內(nèi)膜和動脈中層斑塊的生長,過度的VSMCs增殖已被證明在AS發(fā)生過程中非常重要[40]。CCK8實驗發(fā)現(xiàn)四物湯對未經(jīng)處理的VSMCs增殖無明顯作用,但是在經(jīng)過ox-LDL處理后,四物湯可抑制誘導后的VSMCs過度增殖,對AS的防治產(chǎn)生積極作用。四物湯可明顯提高經(jīng)ox-LDL誘導的VSMCs的NO水平,而四物湯對VSMCs增殖的抑制作用可能通過對NO水平的調(diào)節(jié)來發(fā)揮。eNOS具有抗AS的作用,eNOS表達量的升高也提示了四物湯對防治AS的積極作用;課題組前期研究提示四物湯在多個維度顯示出了雌激素樣作用;研究顯示,雌激素和類雌激素化合物除了對eNOS作用的長期影響外,還存在對NO生物利用度的短期影響,雌激素可能通過經(jīng)典雌激素核受體介導以調(diào)節(jié)eNOS的表達[41];關(guān)于四物湯是否發(fā)揮雌激素樣作用調(diào)節(jié)eNOS水平,需要進一步的實驗探究。由于雌激素對心血管系統(tǒng)具有保護作用,雌激素替代療法已經(jīng)作為臨床上防治女性絕經(jīng)后AS的一種方案,但是由于其伴隨著婦科腫瘤發(fā)病風險的提高而一直備受爭議;本研究結(jié)果提示四物湯可能作為一種雌激素樣藥物對AS進行防治,為藥物的臨床應用提供了部分實驗依據(jù)。

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