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    基于HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路探討油桐花水提物對燙傷大鼠的作用機制

    2021-11-01 05:33:08彭健王永萍劉欣貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院貴陽550002
    中南藥學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:劑量模型

    彭健,王永萍,劉欣(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴陽 550002)

    燒燙傷是指人們在生活或工作中被沸水、油燙傷,或者是被火、電、化學(xué)藥物等灼燒,引起皮膚起泡或深層組織感染、潰爛、形成瘢痕的外傷病[1]。研究表明,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainducible factors-1α,HIF-1α)、Beclin1蛋白及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)的表達與燙傷病理發(fā)展密切相關(guān)。HIF-1α是感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度的最敏感因子,細(xì)胞缺氧程度常用HIF-1α的表達表示,且與自噬表達程度密切相關(guān)[2-3]。燙傷后HIF-1α表達增多,使大量Beclin1蛋白質(zhì)釋放形成自噬泡,誘導(dǎo)大量LC3-Ⅱ合成,導(dǎo)致自噬水平上升[4-6]。Beclin1、LC3-Ⅱ是反映自噬活性的標(biāo)志性蛋白。中醫(yī)認(rèn)為燒燙傷屬于“火毒、熱毒”,常因火毒熱氣內(nèi)攻,致皮肉潰爛,加重病情[7]。油桐為落葉性喬木,屬大戟科油桐屬,油桐花是薔薇亞綱,大戟科植物油桐[Vernicia fordii(Hemsl.)Airy Shaw]的花,主產(chǎn)于我國南方地區(qū),油桐全株皆可入藥,但其根、皮、葉、果實均有毒,臨床應(yīng)用很少。油桐花毒性較小,歸肺、心經(jīng),具有促進傷口愈合、消腫、鎮(zhèn)痛、止血、麻醉等作用[8],古人早已用其治療燒燙傷,療效顯著。本實驗擬通過油桐花水提物調(diào)控HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路的表達來研究油桐花治療燙傷的作用機制。

    1 材料

    1.1 實驗動物

    SPF級Wistar雄性大鼠60只,體質(zhì)量(150±15)g [長沙天勤生物公司,動物許可證:SCXK(湘)2019-0013;實驗動物合格證編號:No.1107262011001163]。

    1.2 試藥

    硫化鈉(批號:20191210,國藥集團),濕潤燒傷膏(批號:13923911455,汕頭美寶制藥),蘇木素染液(批號:C200301)、伊紅染液(批號:C200403)(珠海貝索生物),Beclin1、HIF-1α、LC3-Ⅱ ELISA試劑盒(批號分別為ml059015、ml003167、ml059507,上海酶聯(lián)生物)。Beclin1、HIF-1α、LC3B抗體(批號分別為11306-1-ap、AF1009、AF5402,Affinity)。β-actin抗體(批號:AC026,Abclonal),生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批號:ab6721,英國Abcam)。Prime Script RT reagent Kit(貨號RR047A,寶日生物)。

    1.3 儀器

    QE-300目中藥粉粹機(浙江屹立),DRHH-S8型恒溫水浴鍋(上海雙捷),CTP0011型電子天平(上海友聲衡器),YLS-5Q型燙傷儀(山東益延科技),KD-BM型包埋機(浙江金華科迪),YD-335型石蠟切片機(浙江金華設(shè)備廠),JY-SCZ4+型垂直電泳槽(北京君意公司),5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(上海天能科技)。

    1.4 藥材

    新鮮油桐花采自四川省峨眉山市黃灣鎮(zhèn),花和蒂一并采摘,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為正品。日光下曬干,用粉碎機粉碎,裝入密封塑料袋,備用。前期課題組研究證明油桐花不同溶劑提取物均有一定的抗炎作用,但以水提物抗炎鎮(zhèn)痛作用更明顯[9],因此本實驗采用油桐花水提物進行后續(xù)研究。

    2 方法

    2.1 油桐花水提物制備

    精取油桐花粉末30 g,裝入盛有300 mL蒸餾水的圓底燒瓶,浸泡30 min,恒溫水浴鍋加熱回流2 h,紗布過濾3次,并將紗布中殘留的液體壓出,即得油桐花水提物,質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1(即低劑量0.33 g·kg-1)。將油桐花水提物倒入蒸發(fā)皿中,電爐加熱濃縮,制得質(zhì)量濃度為0.6 g·mL-1、0.3 g·mL-1的油桐花水提物(即高劑量2 g·kg-1,中劑量1 g·kg-1[8])。

    2.2 動物造模及給藥

    參考課題組前期研究[9-10],大鼠隨機分為正常組(n=10)和造模組(n=50),適應(yīng)喂養(yǎng)7 d。20%硫化鈉脫背毛,24 h后造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛,充分麻醉后標(biāo)記燙傷位置,為兩耳連線中點后5 cm。YLS-5Q控溫燙傷儀設(shè)置溫度120℃,實際溫度約90℃,3#燙頭(2.5 cm2)緊貼皮膚燙傷18 s。燙傷前設(shè)置空調(diào)溫度26℃,防止大鼠體溫過低而死亡。燙傷3 d后,隨機選取模型大鼠1只剪取燙傷全層皮膚,放入4%多聚甲醛溶液固定,做HE染色對比。造模成功病理切片可見表皮和真皮大面積壞死,皮下肌纖維變性壞死,炎性細(xì)胞浸潤,出血等一系列病理改變(見圖1)。造模成功后再分為模型組,陽性組(濕潤燒傷膏組),油桐花水提物高、中、低劑量組,每組10只,用記號筆標(biāo)記。油桐花水提物各劑量組分別用棉簽蘸取油桐花水提物2、1、0.33 g·kg-1對大鼠創(chuàng)面進行均勻涂抹。陽性組用棉簽蘸取濕潤燒傷膏均勻涂抹,劑量0.13 g·kg-1,連續(xù)21 d,1次·d-1。正常組和模型組不給藥。

    圖1 大鼠造模前后皮膚組織形態(tài)學(xué)變化(HE,200×)Fig 1 Histomorphological change of the rat skin before and after modeling(HE,200×)

    2.3 取材

    用藥21 d后對各組大鼠背部進行圖片采集。股靜脈取血,3000 r·min-1離心15 min,取上清液,于-80℃保存。剪取正常組皮膚及各燙傷組燙傷全層皮膚組織,一半放入4%多聚甲醛固定,另一半于-80℃儲存,備用。

    2.4 指標(biāo)檢測

    藥物干預(yù)21 d后,油桐花水提物對燙傷大鼠創(chuàng)面愈合的影響可用創(chuàng)面大體圖片、面積及損傷皮膚HE染色來評價。用ELISA法檢測血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ的濃度水平,蛋白質(zhì)印跡法、免疫組化檢測皮膚HIF-1α、Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白質(zhì)表達水平。

    2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    使用SPSS 25.0統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以±s表示,采用組間均數(shù)比較的方法ANOVA,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 對大鼠燙傷創(chuàng)面的影響

    燙傷大鼠創(chuàng)面恢復(fù)圖片見圖2,與模型組比較,不同劑量油桐花水提物和濕潤燒傷膏對大鼠燙傷創(chuàng)面恢復(fù)有明顯效果,傷口明顯減小。

    圖2 油桐花水提物對燙傷大鼠創(chuàng)面的影響Fig 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on scalded wound in scalded rats

    3.2 大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)變化

    大鼠皮膚HE染色顯示,正常皮膚組織表皮結(jié)構(gòu)完整清晰,角化層明顯,復(fù)層扁平上皮層較薄,細(xì)胞排列整齊緊密;真皮內(nèi)膠原纖維排列整齊,胞質(zhì)紅染、均勻;皮下脂肪層及肌層結(jié)構(gòu)清晰可見,脂肪細(xì)胞及肌纖維排列整齊、致密,體積大小均一,細(xì)胞核形態(tài)正常。模型組皮膚有大批纖維組織增生及炎性細(xì)胞,大批皮下組織變性、壞死。與模型組相比,陽性組和高劑量組皮膚組織損傷區(qū)域可見部分膠原纖維交錯排列和較多的纖維細(xì)胞,少量炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主,提示皮膚組織損傷修復(fù)程度相對最好;低劑量組和中劑量組皮膚組織損傷區(qū)域可見較多的纖維細(xì)胞,炎性細(xì)胞較少,提示皮膚組織損傷修復(fù)程度相對較好(見圖3)。

    圖3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚組織病理變化的影響(HE,400×)Fig 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the pathological change of the skin tissue in scalded rats(HE,400×)

    3.3 免疫組化檢測結(jié)果

    與正常組相比,模型組大鼠皮膚組織HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,陽性組,油桐花水提取物高、中劑量組大鼠皮膚組織HIF-1α也明顯降低(P<0.05,P<0.01);陽性組和低劑量組大鼠皮膚組織Beclin1蛋白含量顯著降低(P<0.01);高、中劑量組大鼠皮膚組織Beclin1蛋白含量降低(P<0.05);各劑量組及陽性組大鼠皮膚組織LC3-Ⅱ蛋白含量均不同程度降低(P<0.05)。見表1及圖4。提示油桐花水提物能降低燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的活性表達。

    圖4 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚組織HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表達的影響(免疫組化,400×)Fig 4 Effect of aqueous extract of Tung flower on HIF-1α,Beclin1,LC3-Ⅱ expression in the skin tissue of scalded rats(immunohistochemistry,400×)

    表1 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達的影響(±s,n=10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α,Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s,n=10)

    表1 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達的影響(±s,n=10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α,Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s,n=10)

    注(Note):與正常組相比,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01(Compared with the normal group,**P<0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01)。

    組別 HIF-1α Beclin1 LC3-Ⅱ正常組 0.2019±0.0042 0.2146±0.0061 0.2110±0.0062模型組 0.2240±0.0119**0.2401±0.0141**0.2355±0.0067**陽性組 0.2025±0.0046##0.2122±0.0063##0.2170±0.0147#高劑量組 0.2037±0.0014# 0.2176±0.0031# 0.2190±0.0025#中劑量組 0.2044±0.0080# 0.2207±0.0095# 0.2179±0.0062#低劑量組 0.2189±0.0124 0.2157±0.0111##0.2201±0.0037#

    3.4 對大鼠血清HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響

    由表2可知,與正常組比較,模型組血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,陽性組與油桐花水提物高、中劑量組大鼠血清中HIF-1α濃度明顯降低(P<0.05);陽性組,油桐花水提物各劑量組血清中Beclin1濃度降低(P<0.05,P<0.01);陽性組,油桐花水提物高、中劑量組的大鼠血清中LC3-Ⅱ 濃度降低(P<0.05,P<0.01)。提示油桐花水提物能抑制燙傷大鼠血清HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ的表達。

    表2 油桐花水提物對燙傷大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響(±s,n=10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α,Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s,n=10)

    表2 油桐花水提物對燙傷大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響(±s,n=10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α,Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s,n=10)

    注(Note):與正常組相比,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01(Compared with the normal group,**P<0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01)。

    組別 HIF-1α/(pg·mL-1)LC3-Ⅱ/(pg·mL-1)正常組 51.326±1.875 9.191±0.646 742.507±58.647模型組 56.070±2.570** 11.338±0.645** 876.069±60.161**陽性組 52.286±3.670# 9.677±0.565## 760.148±52.932##高劑量組 51.980±3.189# 9.990±1.144# 764.556±63.867##中劑量組 52.403±2.469# 10.128±1.087# 779.019±65.049#低劑量組 54.560±2.238 9.966±0.875# 838.497±58.231 Beclin1/(ng·mL-1)

    3.5 皮膚組織蛋白質(zhì)印跡法檢測HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表達情況

    模型組大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達均顯著高于正常組(P<0.01)。給藥21 d后,與模型組相比,各組大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低(P<0.05,P<0.01)。提示油桐花水提物能降低燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的蛋白表達,見表3及圖5。

    圖5 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達影響Fig 5 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1 α,Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat

    表3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達影響(±s,n=10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α,Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s,n=10)

    表3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達影響(±s,n=10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α,Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s,n=10)

    注(Note):與正常組相比,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01(Compared with the normal group,**P<0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01)。

    LC3-Ⅱ/(pg·mL-1)正常組 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000模型組 1.6349±0.0949**1.8725±0.3075**2.2788±0.5448**陽性組 1.1659±0.0385##1.3667±0.1973##1.5265±0.2533#高劑量組 1.2659±0.0790##1.1412±0.0631##1.4509±0.4272#中劑量組 1.3620±0.1447##1.3718±0.1261##1.6267±0.2611#低劑量組 1.4574±0.0862# 1.4910±0.0923# 1.6499±0.2459#組別 HIF-1α/(pg·mL-1)Beclin1/(ng·mL-1)

    4 討論

    本課題組前期已掌握了油桐花水提物制備方法,發(fā)現(xiàn)其水提物的效果最優(yōu)。燒燙傷是由外部熱力致皮膚組織損傷,進而缺血缺氧,變性壞死的疾病[11],組織細(xì)胞缺氧與自噬是其損傷的兩大靶點。本研究通過油桐花水提物外用直接干預(yù)其信號通路上的關(guān)鍵蛋白治療燙傷。

    組織缺氧程度常用HIF-1α表達水平表示,檢測自噬活性常選用Beclin1、LC3-Ⅱ 作為目標(biāo)蛋白。研究表明,下調(diào)HIF-1α可抑制Beclin1、LC3-Ⅱ 表達[12],實驗及臨床中常通過調(diào)控這3種因子表達來達到治療目的[12]。用藥干預(yù)后HE染色結(jié)果證明,油桐花水提物可促進燙傷皮膚組織損傷修復(fù)。從創(chuàng)面恢復(fù)圖片、創(chuàng)面大小、HE染色結(jié)果看,油桐花水提物治療燙傷療效是肯定的。免疫組化、ELISA、Western blot等檢測結(jié)果提示油桐花水提物可通過調(diào)控缺氧與自噬信號通路治療燙傷。

    綜上,大鼠皮膚燙傷會導(dǎo)致皮膚組織細(xì)胞缺氧[13],自噬增強。油桐花水提物可抑制HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路開放,緩解燙傷大鼠皮膚組織缺氧,抑制細(xì)胞過度自噬而帶來的損傷,恢復(fù)燙傷創(chuàng)面,與陽性藥物濕潤燒傷膏的作用相似。本實驗為后續(xù)研究油桐花水提物其他作用機制與臨床開發(fā)應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。

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