基于HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路探討油桐花水提物對燙傷大鼠的作用機(jī)制

彭健，王永萍，劉欣（貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002）

燒燙傷是指人們在生活或工作中被沸水、油燙傷，或者是被火、電、化學(xué)藥物等灼燒，引起皮膚起泡或深層組織感染、潰爛、形成瘢痕的外傷病[1]。研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factors-1α，HIF-1α）、Beclin1蛋白及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）的表達(dá)與燙傷病理發(fā)展密切相關(guān)。HIF-1α是感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度的最敏感因子，細(xì)胞缺氧程度常用HIF-1α的表達(dá)表示，且與自噬表達(dá)程度密切相關(guān)[2-3]。燙傷后HIF-1α表達(dá)增多，使大量Beclin1蛋白質(zhì)釋放形成自噬泡，誘導(dǎo)大量LC3-Ⅱ合成，導(dǎo)致自噬水平上升[4-6]。Beclin1、LC3-Ⅱ是反映自噬活性的標(biāo)志性蛋白。中醫(yī)認(rèn)為燒燙傷屬于“火毒、熱毒”，常因火毒熱氣內(nèi)攻，致皮肉潰爛，加重病情[7]。油桐為落葉性喬木，屬大戟科油桐屬，油桐花是薔薇亞綱，大戟科植物油桐[Vernicia fordii（Hemsl.）Airy Shaw]的花，主產(chǎn)于我國南方地區(qū)，油桐全株皆可入藥，但其根、皮、葉、果實均有毒，臨床應(yīng)用很少。油桐花毒性較小，歸肺、心經(jīng)，具有促進(jìn)傷口愈合、消腫、鎮(zhèn)痛、止血、麻醉等作用[8]，古人早已用其治療燒燙傷，療效顯著。本實驗擬通過油桐花水提物調(diào)控HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路的表達(dá)來研究油桐花治療燙傷的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（150±15）g [長沙天勤生物公司，動物許可證：SCXK（湘）2019-0013；實驗動物合格證編號：No.1107262011001163]。

1.2 試藥

硫化鈉（批號：20191210，國藥集團(tuán)），濕潤燒傷膏（批號：13923911455，汕頭美寶制藥），蘇木素染液（批號：C200301）、伊紅染液（批號：C200403）（珠海貝索生物），Beclin1、HIF-1α、LC3-Ⅱ ELISA試劑盒（批號分別為ml059015、ml003167、ml059507，上海酶聯(lián)生物）。Beclin1、HIF-1α、LC3B抗體（批號分別為11306-1-ap、AF1009、AF5402，Affinity）。β-actin抗體（批號：AC026，Abclonal），生物素化山羊抗兔IgG（H＋L）（批號：ab6721，英國Abcam）。Prime Script RT reagent Kit（貨號RR047A，寶日生物）。

1.3 儀器

QE-300目中藥粉粹機(jī)（浙江屹立），DRHH-S8型恒溫水浴鍋（上海雙捷），CTP0011型電子天平（上海友聲衡器），YLS-5Q型燙傷儀（山東益延科技），KD-BM型包埋機(jī)（浙江金華科迪），YD-335型石蠟切片機(jī)（浙江金華設(shè)備廠），JY-SCZ4＋型垂直電泳槽（北京君意公司），5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技）。

1.4 藥材

新鮮油桐花采自四川省峨眉山市黃灣鎮(zhèn)，花和蒂一并采摘，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為正品。日光下曬干，用粉碎機(jī)粉碎，裝入密封塑料袋，備用。前期課題組研究證明油桐花不同溶劑提取物均有一定的抗炎作用，但以水提物抗炎鎮(zhèn)痛作用更明顯[9]，因此本實驗采用油桐花水提物進(jìn)行后續(xù)研究。

2 方法

2.1 油桐花水提物制備

精取油桐花粉末30 g，裝入盛有300 mL蒸餾水的圓底燒瓶，浸泡30 min，恒溫水浴鍋加熱回流2 h，紗布過濾3次，并將紗布中殘留的液體壓出，即得油桐花水提物，質(zhì)量濃度為0.1 g·mL－1（即低劑量0.33 g·kg－1）。將油桐花水提物倒入蒸發(fā)皿中，電爐加熱濃縮，制得質(zhì)量濃度為0.6 g·mL－1、0.3 g·mL－1的油桐花水提物（即高劑量2 g·kg－1，中劑量1 g·kg－1[8]）。

2.2 動物造模及給藥

參考課題組前期研究[9-10]，大鼠隨機(jī)分為正常組（n＝10）和造模組（n＝50），適應(yīng)喂養(yǎng)7 d。20%硫化鈉脫背毛，24 h后造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛，充分麻醉后標(biāo)記燙傷位置，為兩耳連線中點后5 cm。YLS-5Q控溫燙傷儀設(shè)置溫度120℃，實際溫度約90℃，3#燙頭（2.5 cm2）緊貼皮膚燙傷18 s。燙傷前設(shè)置空調(diào)溫度26℃，防止大鼠體溫過低而死亡。燙傷3 d后，隨機(jī)選取模型大鼠1只剪取燙傷全層皮膚，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色對比。造模成功病理切片可見表皮和真皮大面積壞死，皮下肌纖維變性壞死，炎性細(xì)胞浸潤，出血等一系列病理改變（見圖1）。造模成功后再分為模型組，陽性組（濕潤燒傷膏組），油桐花水提物高、中、低劑量組，每組10只，用記號筆標(biāo)記。油桐花水提物各劑量組分別用棉簽蘸取油桐花水提物2、1、0.33 g·kg－1對大鼠創(chuàng)面進(jìn)行均勻涂抹。陽性組用棉簽蘸取濕潤燒傷膏均勻涂抹，劑量0.13 g·kg－1，連續(xù)21 d，1次·d－1。正常組和模型組不給藥。

圖1 大鼠造模前后皮膚組織形態(tài)學(xué)變化（HE，200×）Fig 1 Histomorphological change of the rat skin before and after modeling（HE，200×）

2.3 取材

用藥21 d后對各組大鼠背部進(jìn)行圖片采集。股靜脈取血，3000 r·min－1離心15 min，取上清液，于－80℃保存。剪取正常組皮膚及各燙傷組燙傷全層皮膚組織，一半放入4%多聚甲醛固定，另一半于－80℃儲存，備用。

2.4 指標(biāo)檢測

藥物干預(yù)21 d后，油桐花水提物對燙傷大鼠創(chuàng)面愈合的影響可用創(chuàng)面大體圖片、面積及損傷皮膚HE染色來評價。用ELISA法檢測血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ的濃度水平，蛋白質(zhì)印跡法、免疫組化檢測皮膚HIF-1α、Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用組間均數(shù)比較的方法ANOVA，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠燙傷創(chuàng)面的影響

燙傷大鼠創(chuàng)面恢復(fù)圖片見圖2，與模型組比較，不同劑量油桐花水提物和濕潤燒傷膏對大鼠燙傷創(chuàng)面恢復(fù)有明顯效果，傷口明顯減小。

圖2 油桐花水提物對燙傷大鼠創(chuàng)面的影響Fig 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on scalded wound in scalded rats

3.2 大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)變化

大鼠皮膚HE染色顯示，正常皮膚組織表皮結(jié)構(gòu)完整清晰，角化層明顯，復(fù)層扁平上皮層較薄，細(xì)胞排列整齊緊密；真皮內(nèi)膠原纖維排列整齊，胞質(zhì)紅染、均勻；皮下脂肪層及肌層結(jié)構(gòu)清晰可見，脂肪細(xì)胞及肌纖維排列整齊、致密，體積大小均一，細(xì)胞核形態(tài)正常。模型組皮膚有大批纖維組織增生及炎性細(xì)胞，大批皮下組織變性、壞死。與模型組相比，陽性組和高劑量組皮膚組織損傷區(qū)域可見部分膠原纖維交錯排列和較多的纖維細(xì)胞，少量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，提示皮膚組織損傷修復(fù)程度相對最好；低劑量組和中劑量組皮膚組織損傷區(qū)域可見較多的纖維細(xì)胞，炎性細(xì)胞較少，提示皮膚組織損傷修復(fù)程度相對較好（見圖3）。

圖3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚組織病理變化的影響（HE，400×）Fig 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the pathological change of the skin tissue in scalded rats（HE，400×）

3.3 免疫組化檢測結(jié)果

與正常組相比，模型組大鼠皮膚組織HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性組，油桐花水提取物高、中劑量組大鼠皮膚組織HIF-1α也明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性組和低劑量組大鼠皮膚組織Beclin1蛋白含量顯著降低（P＜0.01）；高、中劑量組大鼠皮膚組織Beclin1蛋白含量降低（P＜0.05）；各劑量組及陽性組大鼠皮膚組織LC3-Ⅱ蛋白含量均不同程度降低（P＜0.05）。見表1及圖4。提示油桐花水提物能降低燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的活性表達(dá)。

圖4 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚組織HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)的影響（免疫組化，400×）Fig 4 Effect of aqueous extract of Tung flower on HIF-1α，Beclin1，LC3-Ⅱ expression in the skin tissue of scalded rats（immunohistochemistry，400×）

表1 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達(dá)的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s，n＝10)

表1 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達(dá)的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s，n＝10)

注（Note）：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

組別 HIF-1α Beclin1 LC3-Ⅱ正常組 0.2019±0.0042 0.2146±0.0061 0.2110±0.0062模型組 0.2240±0.0119**0.2401±0.0141**0.2355±0.0067**陽性組 0.2025±0.0046##0.2122±0.0063##0.2170±0.0147#高劑量組 0.2037±0.0014# 0.2176±0.0031# 0.2190±0.0025#中劑量組 0.2044±0.0080# 0.2207±0.0095# 0.2179±0.0062#低劑量組 0.2189±0.0124 0.2157±0.0111##0.2201±0.0037#

3.4 對大鼠血清HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響

由表2可知，與正常組比較，模型組血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組與油桐花水提物高、中劑量組大鼠血清中HIF-1α濃度明顯降低（P＜0.05）；陽性組，油桐花水提物各劑量組血清中Beclin1濃度降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性組，油桐花水提物高、中劑量組的大鼠血清中LC3-Ⅱ 濃度降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示油桐花水提物能抑制燙傷大鼠血清HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ的表達(dá)。

表2 油桐花水提物對燙傷大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s，n＝10)

表2 油桐花水提物對燙傷大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s，n＝10)

注（Note）：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

組別 HIF-1α/（pg·mL－1）LC3-Ⅱ/（pg·mL－1）正常組 51.326±1.875 9.191±0.646 742.507±58.647模型組 56.070±2.570** 11.338±0.645** 876.069±60.161**陽性組 52.286±3.670# 9.677±0.565## 760.148±52.932##高劑量組 51.980±3.189# 9.990±1.144# 764.556±63.867##中劑量組 52.403±2.469# 10.128±1.087# 779.019±65.049#低劑量組 54.560±2.238 9.966±0.875# 838.497±58.231 Beclin1/（ng·mL－1）

3.5 皮膚組織蛋白質(zhì)印跡法檢測HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)情況

模型組大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均顯著高于正常組（P＜0.01）。給藥21 d后，與模型組相比，各組大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示油桐花水提物能降低燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的蛋白表達(dá)，見表3及圖5。

圖5 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)影響Fig 5 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat

表3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s，n＝10)

表3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s，n＝10)

注（Note）：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

LC3-Ⅱ/（pg·mL－1）正常組 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000模型組 1.6349±0.0949**1.8725±0.3075**2.2788±0.5448**陽性組 1.1659±0.0385##1.3667±0.1973##1.5265±0.2533#高劑量組 1.2659±0.0790##1.1412±0.0631##1.4509±0.4272#中劑量組 1.3620±0.1447##1.3718±0.1261##1.6267±0.2611#低劑量組 1.4574±0.0862# 1.4910±0.0923# 1.6499±0.2459#組別 HIF-1α/（pg·mL－1）Beclin1/（ng·mL－1）

4 討論

本課題組前期已掌握了油桐花水提物制備方法，發(fā)現(xiàn)其水提物的效果最優(yōu)。燒燙傷是由外部熱力致皮膚組織損傷，進(jìn)而缺血缺氧，變性壞死的疾病[11]，組織細(xì)胞缺氧與自噬是其損傷的兩大靶點。本研究通過油桐花水提物外用直接干預(yù)其信號通路上的關(guān)鍵蛋白治療燙傷。

組織缺氧程度常用HIF-1α表達(dá)水平表示，檢測自噬活性常選用Beclin1、LC3-Ⅱ 作為目標(biāo)蛋白。研究表明，下調(diào)HIF-1α可抑制Beclin1、LC3-Ⅱ 表達(dá)[12]，實驗及臨床中常通過調(diào)控這3種因子表達(dá)來達(dá)到治療目的[12]。用藥干預(yù)后HE染色結(jié)果證明，油桐花水提物可促進(jìn)燙傷皮膚組織損傷修復(fù)。從創(chuàng)面恢復(fù)圖片、創(chuàng)面大小、HE染色結(jié)果看，油桐花水提物治療燙傷療效是肯定的。免疫組化、ELISA、Western blot等檢測結(jié)果提示油桐花水提物可通過調(diào)控缺氧與自噬信號通路治療燙傷。

綜上，大鼠皮膚燙傷會導(dǎo)致皮膚組織細(xì)胞缺氧[13]，自噬增強(qiáng)。油桐花水提物可抑制HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路開放，緩解燙傷大鼠皮膚組織缺氧，抑制細(xì)胞過度自噬而帶來的損傷，恢復(fù)燙傷創(chuàng)面，與陽性藥物濕潤燒傷膏的作用相似。本實驗為后續(xù)研究油桐花水提物其他作用機(jī)制與臨床開發(fā)應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。