基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討化濁祛濕方預(yù)防動脈粥樣硬化的作用機制

陳興娟，王婷婷 ，胡 影，，李思明，侯承志，馮 玲

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是指血管內(nèi)皮上的炎性因子侵襲、脂質(zhì)沉積、血小板及白細胞等聚集、纖維組織增生而形成血栓斑塊，引起動脈管腔狹窄、閉塞，甚至破裂出血的病理過程[1]。AS是造成心腦血管疾病的主要原因，嚴重威脅人類的生命健康[2]。有效防治 AS 成為預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵。目前抗AS的治療主要通過他汀類降脂藥物進行干預(yù)，但其作為長期用藥的安全性備受關(guān)注。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種結(jié)合醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、計算機科學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科基礎(chǔ)理論與研究手段，系統(tǒng)綜合地反映藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機制[3]。這種研究方法與中醫(yī)藥復(fù)方的作用多靶點、多途徑有很大相關(guān)性，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)梳理藥物靶點信息，尋找可能的作用機制，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了新的研究方法。中藥復(fù)方抗AS的作用受到越來越多的關(guān)注，化濁祛濕方是國醫(yī)大師路志正教授多年的臨床有效經(jīng)驗方，前期研究顯示其具有一定的降脂和抗AS作用，為了闡釋其作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從化濁祛濕方的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，分析化濁祛濕方抗AS的分子機制，為后續(xù)課題研究提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化濁祛濕方相關(guān)靶點篩選 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[4]找化濁祛濕方中6味中藥名稱，即紫蘇、厚樸、枳實、郁金、杏仁、茵陳的中藥化學(xué)組成成分，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的2個藥代動力學(xué)(ADME)屬性值進行初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點，并根據(jù)已發(fā)表的文獻報道補充未預(yù)測到的活性化合物的已知靶點。篩選結(jié)束后，統(tǒng)一在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)將活性化合物作用轉(zhuǎn)化為標準名稱。

1.2 AS靶點篩選 通過TTD數(shù)據(jù)庫[5]、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫[6]等，以“Atherosclerosis”或“Arteriosclerosis”為疾病關(guān)鍵詞檢索潛在靶點。從DrugBank數(shù)據(jù)庫[7]尋找治療AS的西藥作用靶點進行補充。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高表明該靶點與疾病聯(lián)系更密切。根據(jù)經(jīng)驗，當靶點過多時則設(shè)定 Score大于中位數(shù)的目標靶點為AS的潛在靶點，合并4個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復(fù)值得到AS靶點。

1.3 藥物及AS靶點共有靶點蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為明確化濁祛濕方藥物及AS靶點之間的關(guān)系，通過Venny 2.1繪制蛋白韋恩圖，取交集靶點。將交集靶點提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[8]構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，其余均為默認設(shè)置，得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)之后將 STRING 平臺篩選出來的相互作用的蛋白基因輸入CytoScape 3.8.2軟件[9]的BisoGeNET插件中，篩選條件為Identifiers下選擇“homo sapiens(human)”“gene identifiers only”，Data Settings下只選擇“protein protein interaction”，進一步分析蛋白質(zhì)的作用關(guān)系。

1.4 基因本體(GO)功能富集分析及京都基因組學(xué)百科全書(KEGG)通路的富集分析 通過將化濁祛濕方與AS共同的靶點錄入Metascape平臺[10](http://metascape.org/gp/index.html)，設(shè)置P<0.01，分析其主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進行富集分析，GO功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到化濁祛濕方和AS共同靶點所富集的信號通路。保存數(shù)據(jù)結(jié)果并采用微生信云平臺對數(shù)據(jù)進行可視化處理。

1.5 構(gòu)建化濁祛濕方-AS靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖 運用CytoScape 3.8.2構(gòu)建化濁祛濕方-AS靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，利用CytoScape 3.8.1內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié) 果

2.1 化濁祛濕方活性成分靶點 通過TCMSP及中國臺灣中醫(yī)資料數(shù)據(jù)庫平臺，初步提取枳實化學(xué)成分65種，厚樸化學(xué)成分139種，郁金化學(xué)成分222種，紫蘇化學(xué)成分328種，杏仁化學(xué)成分113 種，茵陳化學(xué)成分 53種，經(jīng)藥代動力學(xué)篩選后，共獲得具有作用靶點的成分66種，其中枳實18種、厚樸3種、郁金3種、紫蘇13種、杏仁16種、茵陳13種，包括厚樸新酚、新橙皮苷、黃酮等。在UniProt網(wǎng)站將上述成分轉(zhuǎn)換成標準基因靶點，得到枳實成分作用靶點121個，厚樸成分作用靶點38個，郁金成分作用靶點67個，紫蘇成分作用靶點93個，杏仁成分作用靶點67個，茵陳成分作用靶點180個，將所有藥物靶點進行合并后刪除重復(fù)值得到靶點共246個。詳見表1。

表1 化濁祛濕方藥物主要成分

(續(xù)表)

2.2 AS疾病靶點 在疾病靶點數(shù)據(jù)庫TTD、Genecards、DrugBank、DisGeNET查找檢索AS的疾病作用靶點，TTD數(shù)據(jù)庫篩選得到疾病靶點29個，DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選得到疾病靶點47個，Genecards數(shù)據(jù)庫選擇Relevance score值大于6.69的疾病靶點279個，DisGeNET數(shù)據(jù)庫篩選得到疾病潛在靶點239個，4個數(shù)據(jù)庫合并去掉重復(fù)值，共獲得疾病靶點438個。

2.3 化濁祛濕方成分-AS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的化濁祛濕方活性成分靶點與AS疾病靶點取交集，并通過Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es)繪制韋恩圖，得到共同靶點80個。再將共同靶點提交至STRING 11.0平臺，在Setting里設(shè)置篩選條件“highest confidence(≥0.9)”，得到交集靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，將STRING的結(jié)果以文本形成導(dǎo)入CytosCape 3.8.2軟件構(gòu)建 PPI 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖1～圖3。

圖1 化濁祛濕方-AS共同基因靶點

圖2 化濁祛濕方-AS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 化濁祛濕方-AS靶點相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO和KEGG通路富集分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫，將化濁祛濕方與AS共同基因靶點按照P<0.01進行GO和KEGG分析，結(jié)果顯示，生物過程(BP)相關(guān)條目1 693個，分子功能(MF)相關(guān)條目93個，細胞組成(CC)相關(guān)條目52個?？梢姸鄠€靶點與脂質(zhì)代謝相關(guān)，化濁祛濕方參與的生物學(xué)過程包括細胞對脂質(zhì)應(yīng)答(cellular response to lipid)、細胞黏附調(diào)節(jié)(regulation of cell adhesion)、膽固醇代謝過程(cholesterol metabolic process)、脂質(zhì)生物合成過程的調(diào)控(regulation of lipid biosynthetic process)、胰島素分泌調(diào)節(jié)(insulin secretion)等；細胞主要涉及膜區(qū)、細胞外基質(zhì)、胞質(zhì)泡腔等方面。詳見圖4。

圖4 化濁祛濕方主要成分潛在靶點的GO富集分析

通過KEGG通路富集分析得到277條通路，以P<0.01 并結(jié)合相關(guān)文獻進行篩選，有59個和AS相關(guān)的通路，選取前20個通路輸入微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn)制作可視化富集氣泡圖，分析得出，可能發(fā)揮作用的通路集中在AGE-RAGE 信號通路、白介素-17(IL-17)信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、Toll樣受體通路、脂肪細胞中脂肪分解的通路等。詳見圖5、表2。

圖5 化濁祛濕方KEGG通路氣泡圖

表2 化濁祛濕方調(diào)治AS靶點通路富集結(jié)果

(續(xù)表)

2.5 化濁祛濕方-AS靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將以上共有靶點和所獲得的通路靶點建立network和type文件，運用CytoScape 3.8.2構(gòu)建化濁祛濕方成分-AS靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，通過CytoScape 3.8.2內(nèi)置的NetworkAnalyzer分析化濁祛濕方治療AS網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，槲皮素連接度為55，介度為0.295，緊密度為0.554，預(yù)測槲皮素為化濁祛濕方治療AS的主要成分，其次為木犀草素(連接度為21，介度為0.032，緊密度為0.442)、柚皮素(連接度為19，介度為0.068，緊密度為0.432)，川陳皮素(連接度為13，介度為0.026，緊密度為0.420)。環(huán)氧合酶-2(PTGS2)在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為58，介度為0.336，緊密度為0.579，預(yù)測PTGS2為化濁祛濕方治療AS的最主要靶點，SCN5A、MAPK14、NOS2、ESR1、PPARG、IL6、MAPK1、TNF、MAPK8、AKT1、PIK3CG、IL1B等也為重要作用靶點。詳見圖 6、表3。

圖6 化濁祛濕方-AS-通路

表3 化濁祛濕方主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

3 討 論

化濁祛濕方是國醫(yī)大師路志正在臨證多年總結(jié)的有效經(jīng)驗方，在治療AS時重在調(diào)節(jié)中焦脾胃，采用運脾化濁法治療血脂異常[11]。脾以健運為主，脾運失常，中焦運化失宜，則痰濁易生，痰濁瘀滯于血脈，形成AS。因此，路志正教授提出通過調(diào)節(jié)中焦脾運，以“持中央、納化?！钡闹委熕枷?，調(diào)節(jié)中焦脾胃運化功能，使痰濁無以生，血脈調(diào)和，則病無所生[12-13]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了化濁祛濕方抗AS的活性成分為槲皮素、木犀草素、柚皮素、川陳皮素等。槲皮素是茵陳的有效成分，屬于天然黃酮類，已有研究揭示了其抗炎、抗癌、抗氧化和抗凋亡活性。有研究表明，槲皮素通過 ROS 調(diào)節(jié)的 PI3K/AKT 信號通路抑制炎癥和凋亡，從而減輕高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的AS[14]。槲皮素以濃度依賴的方式增強巨噬細胞中膽固醇外流與 ABCA1 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達，并且可能通過SCAP-SREBP2-LDLr信號通路改善脂質(zhì)代謝[15-16]。木犀草素是枳實和紫蘇共有的有效成分，木犀草素能通過AMP活化蛋白激酶(AMPK)-Sirtuin(SIRT)1信號傳導(dǎo)降低氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人單核細胞(THP-1)來源的巨噬細胞中總膽固醇水平，同時能抑制巨噬細胞趨化因子和炎性細胞因子表達[17]。柚皮素是郁金和枳實共有的有效成分，柚皮素可抑制脂肪生成并降低脂肪細胞中胰島素敏感性和脂聯(lián)素的表達[18]。

本研究通過GO功能分析和KEGG通路富集解析化濁祛濕方抗AS的分子機制。應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫KEGG通路分析結(jié)果表明，化濁祛濕方的潛在機制主要與AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號途徑、MAPK通路、TNF信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路、PPAR信號通路、Toll樣受體通路、脂肪細胞中脂肪分解的通路等密切相關(guān)。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示化濁祛濕方中有效成分可能是通過PTGS2、PPARG、IL6、MAPK1、TNF、MAPK8、AKT1、PIK3CG、IL1B等共有靶點網(wǎng)絡(luò)起作用。以上多個通路和靶點與脂質(zhì)代謝、炎癥因子等相關(guān)。炎癥反應(yīng)在AS病理發(fā)展過程中起著基礎(chǔ)性作用[19]。AGE/RAGE 信號傳導(dǎo)通路能引起包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多個細胞內(nèi)信號途徑的激活，然后導(dǎo)致NF-κB活性增加[20-21]。核激素受體PPARγ(PPARG)主要促進脂肪生成和巨噬細胞分化，是脂肪形成過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[22]。PTGS2又稱為環(huán)氧合酶-2(COX-2)，而 COX-2 是花生四烯酸代謝過程中調(diào)節(jié)前列腺素合成的限速酶，主要參與機體的各種炎癥反應(yīng)。TNF信號通路、NF-κB信號通路的激活對促進 AS 發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[23]。TNF-α是血管內(nèi)皮細胞損傷或?qū)е卵芄δ芪蓙y的重要炎性因子，能夠激活誘導(dǎo)NF-κB進入細胞核，激活NF-κB信號通路，促使TNF-α、IL-6、IL-8 等炎性因子的釋放，從而引起和加重機體炎癥反應(yīng)[23]。PPAR激活能通過抑制血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)、細胞增殖和遷移、單核細胞轉(zhuǎn)化成泡沫細胞，減少血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達等多個方面，發(fā)揮抗AS作用，PPAR-α在調(diào)節(jié)脂肪代謝過程中，特別是降低ox-LDL的濃度有著重要作用[24-25]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對化濁祛濕方的主要活性化合物及藥理作用進行了初步研究，結(jié)果證實化濁祛濕方多個有效組分可作用于不同靶點，同時各個靶點參與不同的生物過程、分子功能和信號通路，充分體現(xiàn)化濁祛濕方可以起到抗AS的多靶點、多途徑、多通路的特點，為化濁祛濕方從分子生物學(xué)層面提供理論依據(jù)，也為化濁祛濕方后續(xù)實驗研究提供了方向。但限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論的局限性以及中藥組分在煎煮時發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，本研究未將化濁祛濕方煎煮后的化學(xué)成分以及化濁祛濕方活性成分在體內(nèi)的代謝物納入分析。本研究主要是以生物信息學(xué)與海量數(shù)據(jù)計算的結(jié)果為基礎(chǔ)，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進一步篩選與動物或細胞實驗驗證，進而明確化濁祛濕方的主要調(diào)控靶點。