四妙勇安湯“異病同治”動(dòng)脈粥樣硬化與血栓閉塞性脈管炎機(jī)制研究

李藝博　張悅健　李娟　童宏選　盧濤

摘要 目的：通過生物信息分析手段探討四妙勇安湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）與血栓閉塞性脈管炎（TAO）“異病同治”的潛在分子機(jī)制。方法：通過數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘與檢索獲取四妙勇安湯中4味中藥的活性化合物和對(duì)應(yīng)的靶標(biāo);通過GeneCards、比較基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD）以及美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選AS和TAO的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn);運(yùn)用Venny 2.1，獲得藥物作用于二病的共有靶點(diǎn);基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建共有靶蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性化合物-共有靶點(diǎn)-疾病整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。使用Bioconductor生物信息軟件包進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：四妙勇安湯與AS、TAO的共有靶點(diǎn)主要為VEGFA、IL6、JUN、TNF、FOS、MAPK8、MMP9、IL10、ICAM1等計(jì)47個(gè);篩選出以黃酮類和甾醇類為主的有效活性成分計(jì)9個(gè);KEGG通路富集得到的這些靶點(diǎn)共同參與糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE、TNF、動(dòng)脈粥樣硬化與流體剪切應(yīng)力、人巨細(xì)胞病毒感染、細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體等多條通路調(diào)節(jié)。結(jié)論：四妙勇安湯通過抗炎、減少斑塊形成、免疫反應(yīng)、改變血液流變等多條生物學(xué)通路發(fā)揮藥理作用，證實(shí)了其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的調(diào)節(jié)特點(diǎn)，預(yù)測(cè)了四妙勇安湯“異病同治”AS與TAO的潛在分子機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 四妙勇安湯;動(dòng)脈粥樣硬化;血栓閉塞性脈管炎;異病同治;潛在作用機(jī)制;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Abstract Objective：To explore the the common key target and signaling pathway of Simiao Yong′an（SMYA） Decoction in treating atherosclerosis and thromboangiitis obliterans by bioinformatic analysis.Methods：The active compounds and corresponding targets of 4 traditional Chinese medicines from SMYA Decoction were obtained by database mining and retrieval.The associated targets of AS and TAO were screened by GeneCards，CTD and NCBI database.Venny 2.1 was used to obtain the common targets of the two diseases of drug action.The PPI network of common target proteins was constructed through STRING database.Cytoscape 3.7.2 software was used to construct drug-active compound-common target-disease global regulatory network diagrams.The GO classified enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed using Bioconductor platform.Results：The common targets of SMYA Decoction in As and Tao were mainly 47，including VEGFA，IL6，Jun，TNF，F(xiàn)OS，MAPK8，MMP9，IL10，ICAM1，etc.A total of 9 active components，mainly flavonoids and sterols，were screened out.These targets were enriched by KEGG pathway and participate in the regulation of multiple pathways such as AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，TNF signaling pathway，fluid shear stress and atherosclerosis，human cytomegalovirus infection，apoptosis，T cell receptor signaling pathway.Conclusion：The pharmacological effects of SMYA Decoction through anti-inflammation，reducing plaque formation and immune response，changing blood flow changes and other biological pathways have confirmed its multi-component，multi-target and multi-pathway regulatory characteristics.Simultaneously，the study has predicted the potential molecular mechanism for the “same treatment for different diseases” of AS and TAO，and provided theoretical basis for experimental design and further research in traditional Chinese medicine.

Keywords Simiao Yong′an（SMYA） Decoction; Atherosclerosis; Thromboangiitis obliterans; Treating different diseases with same method; Potential mechanism of action; Network pharmacology

中圖分類號(hào)：R285.6;R543.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.002

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種危害人類健康的慢性心血管疾病，是老年人最常見的死亡原因之一，占心血管疾病死亡總?cè)藬?shù)的3/4[1-2]。其主要病變是大中動(dòng)脈血管內(nèi)壁脂質(zhì)沉積，伴平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)增生，并逐漸發(fā)展為成片的粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致動(dòng)脈管腔狹窄、破裂出血，甚至引發(fā)急性心血管疾病，炎癥在AS斑塊的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[3]。在治療方面，臨床主要聚焦抗炎、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、溶栓等方面，但這些治療具有一定的局限性和不良反應(yīng)[4]。根據(jù)其病理變化和臨床特征，歸屬于中醫(yī)學(xué)“痰證、瘀證、胸痹、真心痛”等范疇，病機(jī)主要為臟腑功能紊亂、氣血津液失調(diào)，導(dǎo)致氣滯、血瘀、寒凝、痰濕等病理現(xiàn)象[5]。血栓閉塞性脈管炎（Thromboangiitis Obliterans，TAO）為血管壁節(jié)段性、非化膿性炎癥反應(yīng)伴腔內(nèi)血栓形成，管腔阻塞引起肢體缺血而產(chǎn)生疼痛、間歇性跛行、足背動(dòng)脈減弱等，嚴(yán)重者出現(xiàn)肢端潰瘍、壞死，甚至致殘，屬于中醫(yī)“脫疽”的范疇，病機(jī)為氣血凝滯、經(jīng)脈阻塞[6-7]。TAO的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床主要以抗血小板、擴(kuò)張血管藥物和手術(shù)治療為主要手段[8];但藥物作用單一，手術(shù)存在差異性大、價(jià)格昂貴等問題，不能從根本上延緩或控制疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。中醫(yī)藥不良反應(yīng)小，多組分、多靶點(diǎn)的治療特點(diǎn)在近幾年越來越受到大眾的關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。

四妙勇安湯最早出現(xiàn)在《華佗神醫(yī)秘傳》，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草4味藥組成[10]。根據(jù)辨證論治思維，AS與TAO雖然臨床表現(xiàn)和發(fā)病部位均不相同，但病機(jī)相似，病理上均與熱毒蘊(yùn)結(jié)、氣血瘀滯、陰液耗傷相關(guān)，可用通絡(luò)活血、益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀、清熱解毒法治之。四妙勇安湯功效滋陰活血解毒，是著名的外科脫疽方，臨床研究已證明可用于AS、TAO的疾病治療[11]，符合中醫(yī)“異病同治”的理論思想。此外，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、調(diào)節(jié)血脂、抗凝、抑制血栓形成、改善血液流變學(xué)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用[12-16]。這可能是其“異病同治”的研究基礎(chǔ)。

異病同治最早出自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，指不同的疾病，在其發(fā)展過程中，由于辨證出現(xiàn)了相同的病機(jī)，因而采用同一方法治療的法則，均可獲得理想的治療效果[17]。從古至今，“異病同治”法在指導(dǎo)中醫(yī)臨床診療上發(fā)揮著重要作用，但其內(nèi)在機(jī)制仍有待探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究屬于生物信息分析的手段之一，是近年興起的藥物研究新途徑，通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對(duì)中藥的效用分子、作用靶點(diǎn)、通路及生物過程進(jìn)行多層分析，從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用，符合中醫(yī)藥多組分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)[18]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，對(duì)四妙勇安湯治療AS與TAO進(jìn)行多層面分析，初步探索其“異病同治”作用機(jī)制及規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯活性成分收集與篩選 四妙勇安湯由金銀花、當(dāng)歸、玄參、甘草4味中藥組成。本研究依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為篩選條件，收集與篩選四妙勇安湯的候選活性化合物。

1.2 四妙勇安湯潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取候選化合物相應(yīng)的潛在靶標(biāo)。運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//uniprot.org/），限定物種為人（Homo Sapiens），將得到的靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化為基因名稱（Gene Symbol）。

1.3 四妙勇安湯治療AS、TAO的靶點(diǎn)獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/），美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），比較基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/）分別鍵入“atherogenesis，atherosclerosis，atheroscleroses”（AS）與“thromboangitis obliterans，buerger disease，buerger′s disease”（血栓閉塞性脈管炎），選擇物種為“Homo sapiens”，獲取AS、TAO的疾病靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），將四妙勇安湯的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)映射到疾病的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，以獲得藥物治療AS、TAO的潛在作用靶點(diǎn)及共有靶點(diǎn)。

1.4 潛在共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），以intersection score>0.400為篩選標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5 “藥物-活性化合物-潛在靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將四妙勇安湯的藥物、活性化合物、藥物治療的潛在靶點(diǎn)及疾病信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建四妙勇安湯異病同治AS、TAO的全鏈網(wǎng)絡(luò)。

1.6 通路富集分析 運(yùn)用Bioconductor軟件包（http：//www.bioconductor.org/），對(duì)潛在共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析的生物過程分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并用R進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯候選活性化合物的篩選及靶標(biāo)預(yù)測(cè) 共檢索到金銀花、當(dāng)歸、玄參、甘草的688個(gè)化合物，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18，篩選獲得候選活性化合物計(jì)126個(gè)，其中，金銀花23個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，玄參9個(gè)，甘草92個(gè)，去掉重復(fù)項(xiàng)，共獲得120個(gè)候選活性化合物。獲得205個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。見表1。

2.2 四妙勇安湯治療AS、TAO的共有靶點(diǎn)獲取 獲得AS疾病靶點(diǎn)5 144個(gè)，TAO疾病靶點(diǎn)744個(gè)。四妙勇安湯活性化合物調(diào)控的205個(gè)靶標(biāo)分別與以上2個(gè)疾病靶點(diǎn)交集的韋恩圖見圖1。獲得四妙勇安湯調(diào)控疾病的共有靶標(biāo)47個(gè)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建“四妙勇安湯-共有靶標(biāo)-AS-血栓閉塞性脈管炎”網(wǎng)絡(luò)。見圖2。此外，調(diào)控AS的潛在靶標(biāo)184個(gè)，血栓閉塞性脈管炎49個(gè)。

2.3 共有靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將47個(gè)共有靶標(biāo)導(dǎo)入STRING進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，通過Cytoscape 3.7.2進(jìn)行圖像可視化。圖中計(jì)47個(gè)節(jié)點(diǎn)，480條邊。以節(jié)點(diǎn)示蛋白，以邊表示節(jié)點(diǎn)間的相互作用。某點(diǎn)度值表征連接到該節(jié)點(diǎn)的邊數(shù)，以此來反映節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。圖示節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表示該節(jié)點(diǎn)度值越大。共有靶標(biāo)的平均節(jié)點(diǎn)度值為20.9，超過該值的靶蛋白有23個(gè)。其中，VEGFA、IL6、JUN、TNF、FOS、MAPK8、CASP3、MMP9、STAT3、EGFR、CCL2、IL10、ICAM1、SWRP1NE1、CCND1等度值顯著高于其余靶點(diǎn)。VEGFA的節(jié)點(diǎn)最大，顏色最深。見圖3。

2.4 “藥物-活性化合物-潛在靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將四妙勇安湯的4味中藥、120個(gè)活性化合物、205個(gè)靶標(biāo)及映射到疾病的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)（AS：184個(gè)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，TAO：49個(gè)潛在治療靶點(diǎn)）導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，繪制“藥物-活性化合物-潛在靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共331個(gè)節(jié)點(diǎn)，綠色矩形表示中藥，藍(lán)色橢圓形表示活性化合物，紅色六邊形表示疾病，橙色箭形對(duì)應(yīng)靶標(biāo)。其中，未與疾病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的藥物靶標(biāo)圍繞在四妙勇安湯4味藥的外周，計(jì)19個(gè);三者的共有靶標(biāo)集中在疾病外周的小圈，計(jì)47個(gè);藥物調(diào)控AS的特有靶標(biāo)分布于疾病外周的大圈，計(jì)137個(gè);調(diào)控TAO的特有靶標(biāo)位于大圈之外，計(jì)2個(gè)。每條邊表示中藥、化合物、靶標(biāo)及疾病的相互作用關(guān)系。按照度值等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)指征進(jìn)行關(guān)鍵化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)槲皮素（Quercetin），山柰酚（kaempferol），木犀草素（Luteolin），7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone），β-谷固醇（beta-sitosterol），豆甾醇（Stigmasterol），柚皮素（naringenin），芒柄花素（formononetin），甘草查爾酮A（licochalcone A）等化合物在整個(gè)生物過程中發(fā)揮著重要作用，可能是四妙勇安湯異病同治AS、TAO的共同核心化合物。見圖4。

2.5 關(guān)鍵共有靶點(diǎn)的通路分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物過程分析及KEGG通路富集分析，獲得生物過程條目計(jì)49項(xiàng)，P<0.01，根據(jù)P.adjust優(yōu)選排名前20的GO條目，運(yùn)用R軟件，繪制氣泡圖。關(guān)鍵共有靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合（Cytokine Receptor Binding）、細(xì)胞因子活性（Cytokine Activity）、受體配體活性（Receptor Ligand Activity）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性（Cyclin-dependent Protein Serine/Threonine Kinase Regulator Activity）、蛋白酶結(jié)合（Protease Binding）、聯(lián)合蛋白結(jié)合（Integrin Binding）、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合（Growth Factor Receptor Binding）、R-SMAD結(jié)合（R-SMAD Binding）、蛋白激酶調(diào)節(jié)劑活性（Protein Kinase Regulator Activity）、泛素蛋白連接酶活性（Ubiquitin Protein Ligase Binding）等生物過程中。這提示四妙勇安湯通過各項(xiàng)生物過程的多維調(diào)控，從而異病同治AS、TAO。見圖5A。

KEGG富集通路篩選得146條P<0.01的通路，將P值較小的20條通路結(jié)果以氣泡圖的形式呈現(xiàn)。這些靶點(diǎn)主要在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、TNF信號(hào)通路（TNF Signaling Pathway）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 Signaling Pathway）、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-associated Herpesvirus Infection）、麻疹（Measles）、動(dòng)脈粥樣硬化與流體剪切應(yīng)力（Fluid Shear Stress and

Atherosclerosis）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human Cytomegalovirus Infection）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T Cell Receptor Signaling Pathway）等富集較多。見圖5B。

3 討論

中醫(yī)藥是一個(gè)巨大的寶庫(kù)，應(yīng)當(dāng)努力挖掘，加以提高。近幾年，中藥處方療效顯著、不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯。但其成分多樣復(fù)雜，治療靶標(biāo)通路多角度的特點(diǎn)也為明確中藥復(fù)方的作用增加了難度。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠在基于生物信息學(xué)分析的前提下，篩選出復(fù)方組成藥物的活性化合物和對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，構(gòu)建“藥物-活性化合物-潛在靶標(biāo)-疾病”的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖譜，其從宏觀到微觀，從整體到局部的特點(diǎn)為中藥復(fù)方的研究提供了新思路和可行性。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，挖掘四妙勇安湯治療AS和TAO的潛在共同作用機(jī)制，為中醫(yī)治病法則之一的“異病同治”提供理論依據(jù)。

TAO中血管內(nèi)皮炎癥、血栓形成、阻塞后末端缺氧壞死等病理過程，同AS及其引起的心腦血管疾病等多個(gè)病理環(huán)節(jié)相似。現(xiàn)代研究表明，AS是一種脂質(zhì)代謝異常引起的慢性炎性疾病，炎癥反應(yīng)始終貫穿于AS整個(gè)過程，在起始與持續(xù)階段都有天然免疫和特異性免疫參與，抗炎成為防治AS新的干預(yù)靶點(diǎn)和方向[19-20]。研究報(bào)道，運(yùn)用四妙勇安湯治療TAO，能降低氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等水平，而這些因子也同樣在AS中明顯升高[21]，符合中醫(yī)“異病同治”的辨證論治思想。

四妙勇安湯具有清熱解毒之效，兼有活血之功，但治療AS和TAO的作用機(jī)制仍在探究中。其組成藥物主要為金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)指征進(jìn)行關(guān)鍵化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)4味藥物均存在度值較高的活性化合物，可能是發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物。其中，槲皮素（Quercetin）是存在于甘草和金銀花中的活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功能，對(duì)氧化損傷的細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時(shí)，能減少炎癥介質(zhì)（IL-1β和IL-6），增加抗炎細(xì)胞因子（IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1），通過抑制核因子κB（NF-κB）和MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，對(duì)AS和TAO的炎癥反應(yīng)起到治療效果[22-24]。山柰酚（Kaempferol）具有多樣的生物學(xué)功效，可通過降低細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，防止AS的發(fā)生[25];抑制還原輔酶Ⅱ，清除脂質(zhì)過氧化，抑制由這些因素引起的氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的AS[26];通過抑制MAPK信號(hào)通路，降低MDC、IP-10、IL-8等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，阻斷Tyk-STA信號(hào)通路，抑制STAT3的激活，發(fā)揮抗炎作用[27-28]。當(dāng)歸和玄參的活性成分β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）在體內(nèi)通過氧化過程產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物，可破壞膽固醇膠束的形成，降低膽固醇水平，抑制膽固醇合成酶（HMG-COA）的表達(dá)，對(duì)AS起到治療作用，同時(shí)通過提高抗炎因子IL-10、酪氨酸磷酸酶（SHP-1）的活性，抑制趨化因子、炎癥介質(zhì)以及NF-κB的遷移，發(fā)揮抗炎作用[29-30]。甘草總黃酮具有抗炎作用，甘草查爾酮A（Licochalcone A）是抗炎的主要成分，通過抑制炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6的釋放發(fā)揮作用[31]。

共有靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）的節(jié)點(diǎn)度值最大，VEGFA是促進(jìn)血管新生的主要生長(zhǎng)因子之一，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)張、增殖和遷移[32-33]。但血管新生通過增加斑塊的形成和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，增高了AS的發(fā)病率[34]。研究表明，四妙勇安湯的化合物成分對(duì)血管具有雙重調(diào)節(jié)作用，VEGFA作為Dll4的上游靶點(diǎn)激活Dll4/Notch1信號(hào)通路，精確調(diào)控血管內(nèi)皮芽生、管狀結(jié)構(gòu)形成，使新生血管成熟并形成有效的供血網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)可減少絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、VEGFA的表達(dá)，抑制血管內(nèi)斑塊的新生，穩(wěn)定易損斑塊[35-37]。還能夠通過上調(diào)絲蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）的表達(dá)、下調(diào)p38MAPK蛋白表達(dá)，改善下肢缺血血運(yùn)重建過程，促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合[38-39]。AS和TAO具有明顯的炎癥反應(yīng)，四妙勇安湯可通過降低血清中IL-6、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-10（IL-10），以及抑制巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[40-42]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一族重要的蛋白酶類，其活性和含量的升高可致細(xì)胞外基質(zhì)迅速降解、纖維帽變薄，使斑塊易于破裂而導(dǎo)致疾病發(fā)生，研究證實(shí)，四妙勇安湯的活性成分可作用于MMP-9，通過降低MMP-9的表達(dá)，升高外膜TIMP-1的表達(dá)，使新生血管的通透性降低，抑制炎癥介質(zhì)等進(jìn)入主動(dòng)脈斑塊，起到穩(wěn)定斑塊的作用[43]。JUN、FOS均屬于激活蛋白酶-1（AP-1），AP-1可刺激生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞的增殖和分化，化合物可通過作用于JUN和FOS，降低斑塊中平滑肌細(xì)胞的含量，從而起到防治AS的作用[44]。此外，GO生物過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性、蛋白酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)劑活性、泛素蛋白連接酶活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、AS與流體剪切應(yīng)力、人巨細(xì)胞病毒感染、細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體信號(hào)通路。其中糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路可激活NF-κB，NF-κB促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)AS相關(guān)基因VCAM-1、VEGF、RAGE的表達(dá)[43-49];TNF信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多條信號(hào)通路，同時(shí)可促進(jìn)低密度脂蛋白在血管內(nèi)壁的沉積，通過活化單核巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，使血管內(nèi)壁增厚，管腔狹窄，血流阻力增大，加速AS和TAO的發(fā)生發(fā)展[50]。剪切力是血流在血管壁內(nèi)皮表面產(chǎn)生的摩擦力，伴隨生理剪切力的持續(xù)層流可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）基因和蛋白的表達(dá)，這些基因和蛋白對(duì)AS具有保護(hù)作用，低剪切力的擾動(dòng)流促進(jìn)動(dòng)脈壁的氧化和炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致AS發(fā)生[51-54]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)四妙勇安湯主要通過抗炎、抗氧化、免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、穩(wěn)定血管內(nèi)斑塊、改變血液流變等多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)AS和TAO進(jìn)行干預(yù)和治療，為中藥復(fù)方臨床研究提供潛在的分子作用機(jī)制。但完全依賴生物信息學(xué)技術(shù)的手段同樣存在一定的局限性，基于已有的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，金銀花的主要成分綠原酸（Heriguard）和當(dāng)歸的主要成分阿魏酸（Ferulic Acid）均不在列表中，玄參的主要成分哈巴俄苷干（Harpagoside）對(duì)過氧化氫引起的血管內(nèi)皮損傷具有一定的保護(hù)作用，但因度值較小，未被篩出[55]。

綜上所述，四妙勇安湯對(duì)AS和TAO的“異病同治”是一個(gè)綜合復(fù)雜的調(diào)控過程，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用為精確研究中藥處方的作用機(jī)制提供了基于“化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的新思路，篩選得到的關(guān)鍵化合物、潛在共有靶點(diǎn)以及作用通路與AS和TAO的病因病機(jī)具有一致性，表明了預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性和研究?jī)r(jià)值，但同時(shí)存在篩選偏差。因此，在對(duì)中醫(yī)藥復(fù)方的研究中應(yīng)將科技手段與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，進(jìn)行全面、整體、綜合的分析，增加中醫(yī)藥研究的科學(xué)內(nèi)涵，為更深層次的研究提供理論依據(jù)。

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（2021-02-23收稿 責(zé)任編輯：張樂杰）