獨(dú)活寄生湯干預(yù)腰椎間盤(pán)突出癥的可視化“藥靶蛋白模型”分析

白子興　董永麗　蔡靜怡　魏戌　高云

摘要 目的：構(gòu)建獨(dú)活寄生湯干預(yù)腰椎間盤(pán)突出癥的“方藥-靶基因-病種”生物預(yù)測(cè)模型，明確獨(dú)活寄生湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的核心靶點(diǎn)及作用通路。方法：首先，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）中的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能收集獨(dú)活寄生湯的化學(xué)成分及靶點(diǎn)，利用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)確定基因靶點(diǎn)簡(jiǎn)稱(chēng);其次，對(duì)在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）、比較基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行腰椎間盤(pán)突出癥疾病靶標(biāo)查詢(xún);最終，綜合提取中藥復(fù)方與疾病的核心作用靶點(diǎn)，借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)和Cytoscape軟件的拓?fù)浞治龉δ?，獲取“方藥-靶基因-病種”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，使用R語(yǔ)言進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，確定獨(dú)活寄生湯干預(yù)腰椎間盤(pán)突出癥的核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵通路。結(jié)果：篩選出獨(dú)活寄生湯202個(gè)有效化學(xué)成分，276個(gè)潛在基因靶點(diǎn)，其中與腰椎間盤(pán)突出癥的共同靶點(diǎn)基因88個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、JUN、MAPK、VEGFA、IL1B是獨(dú)活寄生湯干預(yù)腰椎間盤(pán)突出癥的核心靶點(diǎn)。GO富集分析明確了107個(gè)富集條目，主要涉及蛋白酶的激活、細(xì)胞因子的結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄與RNA聚合酶Ⅱ特異性的富集形態(tài);KEGG通路注釋及富集分析篩選出了153條與獨(dú)活寄生湯相關(guān)的蛋白通路，差異蛋白表達(dá)靠前的通路包括慢性炎癥作用通路IL-17、促炎通路TNF及細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。結(jié)論：獨(dú)活寄生湯配伍科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，靶點(diǎn)覆蓋全面，體現(xiàn)了中醫(yī)的辨證論治與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“精準(zhǔn)治療”的科學(xué)內(nèi)涵。獨(dú)活寄生湯通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路作用于腰椎間盤(pán)突出癥，主要起到抗炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞修復(fù)的作用，后期當(dāng)進(jìn)一步通過(guò)從分子、動(dòng)物、臨床等層面，借助計(jì)算機(jī)、體內(nèi)、體外的一系列技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，為臨床用藥組方提供新思路。

關(guān)鍵詞 獨(dú)活寄生湯;腰椎間盤(pán)突出癥;靶點(diǎn);信號(hào)通路

Abstract Objective：To clarify the core targets and pathways of Duhuo Jisheng Decoction for lumbar disc herniation by constructing a biological predictive model of “prescription-target gene-disease” of Duhuo Jisheng Decoction for intervening lumbar disc herniation.Methods：Firstly，by searching the target predicting function in the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），the chemical component and targets of Duhuo Jisheng Decoction were collected，and the UniProt protein database was used to determine the gene target abbreviations; Secondly，the disease targets of lumbar intervertebral disc herniation were retrieved through the disease databases，including OMIM，DisGeNET，CTD，etc.Finally，the core targets of traditional Chinese medicine compound prescriptions and diseases were extracted with the help of the protein interaction analysis platform of STRING database and the topological analysis function of Cytoscape to obtain the network of “prescription-target gene-disease”.R language was used to perform GO and PPI analysis of KEGG，determining the core target and key pathway of Duhuo Jisheng Decoction in the intervention of lumbar disc herniation.Results：A total of 202 effective chemical components and 276 potential gene targets of Duhuo Jisheng Decoction were screened out，of which 88 are common target genes for lumbar disc herniation.PPI network analysis found that AKT1，IL6，JUN，MAPK，VEGFA，and IL1B are the core targets of Duhuo Jisheng Decoction in the intervention of lumbar disc herniation.GO enrichment analysis identified 107 enrichment items，mainly related to protease activation，cytokine binding，DNA binding transcription and RNA polymerase Ⅱ specific enrichment morphology; KEGG pathway annotation and enrichment analysis screened out 153 protein pathways related to Duhuo Jiesheng Decoction and the pathways with the highest differential protein expression include chronic inflammation pathway IL-17，pro-inflammatory pathway TNF，and the apoptosis signal transduction pathway.Conclusion：Duhuo Jisheng Decoction is scientifically rigorous in compatibility with comprehensive target coverage，which embodies the scientific connotation of TCM syndrome differentiation and treatment and modern medical “precision treatment”.Duhuo Jisheng Decoction acts on lumbar intervertebral disc herniation through multiple targets and multiple pathways.It mainly plays the role of anti-inflammatory immunity and cell repair.Further research from aspects of the molecular，animal，and clinical practice are needed，with the help of computing technology，in vivo，and in vitro to innovate for clinical prescriptions.

Keywords Duhuo Jisheng Decoction; Lumbar disc herniation; Target; Signal pathway

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.6;R681.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.001

腰椎間盤(pán)突出癥（Lumbar Disc Herniation，LDH）是脊柱門(mén)診常見(jiàn)的退行性疾病之一，病理表現(xiàn)為椎間盤(pán)退變，纖維環(huán)破裂，髓核突出，壓迫神經(jīng)導(dǎo)致神經(jīng)根水腫，對(duì)應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)以疼痛、麻木、活動(dòng)受限為主要表現(xiàn)的綜合性病變[1-2]。依據(jù)髓核突出的方向和部位可分為前突出、側(cè)方突出、后方突出、全盤(pán)四周膨出、椎體內(nèi)突出和極外側(cè)型，其中以后方突出中的旁側(cè)型和中央型最為多見(jiàn)，占99%以上[3]。腰椎間盤(pán)突出癥的治療，主要分為保守與手術(shù)2種方式，早期通過(guò)口服非甾體抗炎藥及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)性藥物以緩解疼痛、麻木癥狀，中晚期采用微創(chuàng)或開(kāi)窗減壓術(shù)解除活動(dòng)受限等癥狀[4]。腰椎間盤(pán)突出癥多發(fā)于老年人群，無(wú)論是口服藥物的不良反應(yīng)，還是手術(shù)費(fèi)用，皆為影響腰椎間盤(pán)突出癥治療滿(mǎn)意度的影響因素[5]。中醫(yī)認(rèn)為腰椎間盤(pán)突出癥屬于“痹癥”“腰腿痛”范疇，病因?yàn)橥馐軅麚p，內(nèi)有虧虛或感受風(fēng)寒濕邪。中醫(yī)在辨證論治基礎(chǔ)上，將臨床證候主要分為氣滯血瘀、風(fēng)寒痹阻、濕熱痹阻、肝腎虧虛等，處方用藥堅(jiān)持祛邪兼扶正，治病求本的原則，在腰椎間盤(pán)突出癥的治療上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

獨(dú)活寄生湯來(lái)源于孫思邈的《備急千金要方》：“夫腰背痛者，皆由腎氣虛弱……或腰痛、攣腳重痹，宜急服此方?！苯M方以君藥獨(dú)活除久痹、祛外邪，以細(xì)辛、防風(fēng)、秦艽、肉桂祛風(fēng)寒濕邪為臣，輔以桑寄生、杜仲等補(bǔ)肝腎、益氣血之品，邪正兼顧，祛邪不傷正，扶正不留邪?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為獨(dú)活寄生湯具有抗炎、鎮(zhèn)痛，增強(qiáng)椎間盤(pán)膠原合成，抑制椎間盤(pán)退變，促進(jìn)腰椎間盤(pán)纖維環(huán)修復(fù)，防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生的功能，但其干預(yù)LDH的分子機(jī)制尚未清楚[6-7]。本研究以生信分析為載體，探究獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的分子生物機(jī)制，為臨床醫(yī)師處方用藥提供參考，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供基礎(chǔ)支持。

1 資料與方法

1.1 “獨(dú)活寄生湯”中藥復(fù)方有效化學(xué)組成物的檢索 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），依次查詢(xún)獨(dú)活寄生湯中各中藥的化學(xué)成分，通過(guò)藥物口服生物利用度和類(lèi)藥性篩選出主要化學(xué)成分。將查詢(xún)到的化學(xué)成分“獨(dú)活”“桑寄生”“秦艽”“防風(fēng)”“細(xì)辛”“當(dāng)歸”“川芎”“熟地黃”“白芍”“肉桂”“茯苓”“杜仲”“牛膝”“人參”“甘草”加載到TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模塊進(jìn)行初步蛋白靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)搜集各靶點(diǎn)的基因ID。

1.2 LDH疾病靶點(diǎn)查詢(xún) 以“Lumbar Disc Herniation”為關(guān)鍵詞依次查詢(xún)比較毒物遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、比較基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）和疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET），整合各數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)檢索結(jié)果，剔除多余靶點(diǎn)，留下最終靶點(diǎn)備用。

1.3 疾病LDH與中藥復(fù)方獨(dú)活寄生湯共有靶點(diǎn)的確定 將獨(dú)活寄生湯及LDH基因靶點(diǎn)進(jìn)行分析匯總?cè)〗患?，確定獨(dú)活寄生湯與LDH的共同靶點(diǎn)。借助Venny2.1在線繪圖軟件制作共同靶點(diǎn)文氏圖。

1.4 疾病LDH與中藥復(fù)方獨(dú)活寄生湯可視化網(wǎng)絡(luò)的建立 使用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析疾病LDH與中藥復(fù)方獨(dú)活寄生湯共有靶點(diǎn)，蛋白質(zhì)種類(lèi)為“Homo Sapiens”，最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評(píng)分值>0.7，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，以tsv格式導(dǎo)出，存儲(chǔ)為String_interactions.tsv文件。將.tsv文件代入到R軟件編寫(xiě)的程序中，以靶點(diǎn)蛋白之間的作用次數(shù)為參考，定義互作關(guān)系多的蛋白質(zhì)為核心蛋白，并制作條形圖。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行美化，對(duì)節(jié)點(diǎn)（Node）和邊（Edge）進(jìn)行調(diào)整形成可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.5 獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的基因通路富集分析 將共有靶點(diǎn)代入R軟件及Ultraedit軟件編寫(xiě)的基因通路富集分析程序，對(duì)獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的蛋白質(zhì)進(jìn)行通路富集和生物過(guò)程注釋?zhuān)@得顯著富集的信號(hào)通路（P<0.05），利用Perl軟件獲取富集靶點(diǎn)、通路信息。根據(jù)富集的結(jié)果，獲取最顯著富集（P<0.05）的前20條通路，選擇與研究問(wèn)題最相關(guān)的通路，結(jié)合基因表達(dá)量變化的程度，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 中藥獨(dú)活寄生湯復(fù)方化學(xué)成分篩選結(jié)果 初步檢索到已知的獨(dú)活寄生湯活性成分1 939個(gè)，其中獨(dú)活99個(gè)、桑寄生46個(gè)、秦艽27個(gè)、防風(fēng)173個(gè)、細(xì)辛192個(gè)、當(dāng)歸125個(gè)、川芎189個(gè)、地黃76個(gè)、白芍85個(gè)、肉桂100個(gè)、茯苓34個(gè)、杜仲147個(gè)、牛膝176個(gè)、人參190個(gè)、甘草280個(gè)，綜合限定藥物口服生物利用度和類(lèi)藥性的界值后共獲取有效成分202個(gè)。見(jiàn)表1。

2.2 “獨(dú)活寄生湯”藥物、LDH疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 共獲取1 216個(gè)靶點(diǎn)，其中獨(dú)活32個(gè)、桑寄生137個(gè)、秦艽27個(gè)、防風(fēng)61個(gè)、細(xì)辛88個(gè)、當(dāng)歸40個(gè)、川芎22個(gè)、地黃26個(gè)、白芍71個(gè)、肉桂59個(gè)、茯苓9個(gè)、杜仲181個(gè)、牛膝183個(gè)、人參92個(gè)、甘草188個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共276個(gè)靶點(diǎn)。檢索4個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得LDH相關(guān)靶點(diǎn)1 006個(gè)，排除重復(fù)靶點(diǎn)后共包含934個(gè)靶點(diǎn)。將疾病與中藥復(fù)方交集后得到獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH共88個(gè)靶點(diǎn)，包括PTGS2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX等。見(jiàn)圖1。

2.3 疾病-靶點(diǎn)-中藥復(fù)方可視化“藥靶蛋白模型”構(gòu)建 借助Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的可視化“藥靶蛋白模型”。通過(guò)Cytohubba插件分析整合各靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，全部節(jié)點(diǎn)之間的連接關(guān)系依次參考各靶點(diǎn)間Degree的大小來(lái)展示。該網(wǎng)絡(luò)共262個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中，中央紅色多邊形代表疾病LDH，外圍邊緣黃色箭頭代表獨(dú)活寄生湯的中藥復(fù)方藥物組成，天藍(lán)色圓形代表最終篩選的中藥復(fù)方的化學(xué)成分，綠色三角形表示中藥復(fù)方潛在靶點(diǎn)。共發(fā)現(xiàn)3 074條作用線，各節(jié)點(diǎn)之間互相作用關(guān)系分別用紅色、紫色、綠色線條表示。見(jiàn)圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心蛋白確定 PPI網(wǎng)絡(luò)共發(fā)現(xiàn)88個(gè)靶點(diǎn)蛋白，350條作用線。借助R語(yǔ)言軟件與Perl軟件查詢(xún)核心靶點(diǎn)，制作條形圖，直觀反映“獨(dú)活寄生湯”干預(yù)LDH的作用機(jī)制。以縱坐標(biāo)代表靶點(diǎn)名稱(chēng)，橫坐標(biāo)表示各節(jié)點(diǎn)的相互作用數(shù)目，通過(guò)分析各節(jié)點(diǎn)的相互作用關(guān)系，獲取TOP30的靶點(diǎn)為獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)“獨(dú)活寄生湯”中的AKT1、IL6、JUN、MAPK、VEGFA、IL1B等為干預(yù)LDH的核心靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.5 基因本體富集結(jié)果 基因本體（Gene Ontology，GO）富集對(duì)107個(gè)基因進(jìn)行注釋和分類(lèi)目，主要涉及細(xì)胞代謝過(guò)程、泛素樣蛋白連接酶的結(jié)合、內(nèi)肽酶活性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性的表達(dá)、RNA聚合酶Ⅱ特異性表達(dá)等生物過(guò)程。氣泡圖左側(cè)Y軸代表富集出來(lái)的GO Term，X軸的數(shù)字代表Gene Ratio，氣泡的大小表示基因數(shù)量，氣泡的顏色深淺跟p-value相關(guān)，氣泡顏色越大越紅表示越顯著。最上端的Receptor Ligand Activity代表有17%的靶點(diǎn)富集在此生物功能周?chē)?，Gene Ratio值為0.170，氣泡顏色為紅色，說(shuō)明富集最顯著。見(jiàn)圖4。

2.6 京都基因與基因組百科全書(shū)富集結(jié)果可視化結(jié)果 京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析共富集了154條獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH相關(guān)的信號(hào)通路，通過(guò)富集因子的數(shù)目及P值篩選出TOP20的作用通路，獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的核心靶點(diǎn)主要有慢性炎癥作用通路IL-17、促炎通路TNF、細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的信號(hào)通路PI3K-AKT、Th1和Th2細(xì)胞分化及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血管生成的VEGF信號(hào)通路等相關(guān)通路。氣泡圖Y軸代表富集出來(lái)的通路，X軸表示富集基因Gene Ratio，圓的大小代表Gene數(shù);點(diǎn)的顏色代表P值的大小。顏色的深淺與富集的程度呈正相關(guān)，與P值呈負(fù)相關(guān)。如IL-17 signaling pathway富集的基因個(gè)數(shù)為23，基因比例為0.273，氣泡為深紅色，p.adjust為3.48e-24。見(jiàn)圖5。

3 討論

中醫(yī)學(xué)雖然沒(méi)有腰椎間盤(pán)突出癥的病名記載，但是通過(guò)臨證醫(yī)案可以發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)對(duì)于腰椎間盤(pán)突出癥的治療具有獨(dú)特見(jiàn)解，認(rèn)為“風(fēng)寒濕邪，痹阻經(jīng)脈，致使經(jīng)脈不通，不通則痛，久病失治，肝腎虧虛，不榮則痛”，針對(duì)此病機(jī)，獨(dú)活寄生湯通過(guò)祛風(fēng)散寒、解痙通絡(luò)、活血化瘀和補(bǔ)益肝腎綜合治療腰椎間盤(pán)突出癥。遵循中醫(yī)通則不痛的原理，療效徹底，可以達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)，消腫止痛的作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯能夠調(diào)控PGE2的表達(dá)，起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用;大鼠的含藥血清可能通過(guò)調(diào)控Ca M-Ca MK-CREB等信號(hào)通路機(jī)制，促進(jìn)腰椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)。分子生物學(xué)發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯可顯著拮抗SDF-1誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，通過(guò)SDF-1/CXCR4/NF-κB通路，抑制炎癥介質(zhì)的生成;口服藥物后的含藥血清能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、CDK4、Rb、P16的表達(dá)，促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖。充分證明了獨(dú)活寄生湯的抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)的作用[8-9]。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建了藥物與疾病的藥靶蛋白模型，將成分復(fù)雜的中藥轉(zhuǎn)化為以蛋白質(zhì)為主體的系統(tǒng)研究，進(jìn)一步明確獨(dú)活寄生湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的作用機(jī)制[10]。蛋白質(zhì)是我們生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的一個(gè)主要承擔(dān)者，其功能主要通過(guò)基因表達(dá)、遞質(zhì)傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝等過(guò)程發(fā)生作用。PPI網(wǎng)絡(luò)藥靶蛋白模型的構(gòu)建能夠可視化藥物和疾病的組分、過(guò)程和功能。通過(guò)拓?fù)浞治?，快速確定主導(dǎo)疾病生物行為的關(guān)鍵靶點(diǎn)，然后對(duì)藥物的有效成分進(jìn)行藥靶蛋白分析，篩選出作用于疾病的核心有效藥物成分。因此，我們借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獨(dú)活寄生湯全部中藥的有效成分，OMIM、DisGeNET、CTD等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取LDH疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建了由88個(gè)節(jié)點(diǎn)（蛋白質(zhì)）和350條邊（相互作用）構(gòu)成的PPI可視化網(wǎng)絡(luò)藥靶蛋白模型，拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、JUN等為其核心靶點(diǎn)，進(jìn)一步與篩選出獨(dú)活寄生湯的有效活性成分進(jìn)行藥靶蛋白構(gòu)建，得出作用于LDH最相關(guān)的活性成分，如南蛇藤芐酰胺、甘草醇。

獨(dú)活寄生湯中生物化學(xué)成分利用度較高的主要包括：香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等化合物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯能夠有效控制炎癥反應(yīng)，保護(hù)纖維軟骨細(xì)胞，促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞的修復(fù)與再生[11-12];細(xì)胞分子研究明確了獨(dú)活的香豆素成分通過(guò)降低大鼠血清白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，杜仲水煎醇提取物綠原酸為鎮(zhèn)痛抗炎的有效成分[13-14]。牛膝總皂苷通過(guò)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)緩解腰椎間盤(pán)突出癥引起的軟骨退化，牛膝多糖通過(guò)改善腰椎間盤(pán)突出癥的血液循環(huán)，促使腰椎間盤(pán)突出癥的修復(fù)，促進(jìn)軟骨成骨細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的活性[15]。

獨(dú)活寄生湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的核心靶點(diǎn)主要包括AKT1、IL6、JUN、MAPK、VEGFA、IL1B等。王東林[16]研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯能顯著降低患者IL-6、TNF-α水平，緩解腰椎間盤(pán)突出癥患者的疼痛，促進(jìn)患者康復(fù);楊杰科等[17]通過(guò)對(duì)108例腰椎間盤(pán)突出癥患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯能夠通過(guò)減少血漿血栓烷B2和炎癥介質(zhì)TXB2、IL-1β的表達(dá)，提高LDH患者的痛閾，但是對(duì)于神經(jīng)傳導(dǎo)功能的改善效果不佳。張德清等[18]通過(guò)對(duì)獨(dú)活寄生湯干預(yù)厚后的關(guān)節(jié)液進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑液中OPN和VEGF濃度顯著降低。

通過(guò)GO生物富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH主要通過(guò)蛋白層面調(diào)節(jié)DNA、RNA的聚合、轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄因子等途徑發(fā)揮抗腰椎間盤(pán)突出癥作用;細(xì)胞分子方面通過(guò)控制生長(zhǎng)因子結(jié)合、蛋白磷酸酶激活及受體的結(jié)合等細(xì)胞組分參與抗炎鎮(zhèn)痛作用。在關(guān)節(jié)炎軟骨組織中，miR-378c的表達(dá)較高，p-AKT1的表達(dá)不足，可以通過(guò)干擾AKT1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)抑制miR-378c，達(dá)到抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[19-20]。MAPK有利于延緩纖維軟骨細(xì)胞退變，其中，MMP-13能夠通過(guò)Ⅱ型膠原的釋放，加速降解纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，引起軟骨損傷，加重纖維環(huán)的損傷[21];LDH產(chǎn)生的根性癥狀主要由于突出部位壓迫神經(jīng)根，導(dǎo)致神經(jīng)根發(fā)生水腫，產(chǎn)生局部無(wú)菌性炎癥，最終表現(xiàn)為壓迫性疼痛等不適癥狀[22]。TNF-α屬于炎癥介質(zhì)，能夠促進(jìn)IL-1β、IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，參與椎間盤(pán)自身免疫反應(yīng)[23-24]。SOD屬于抗氧化酶，可通過(guò)清除超氧陰離子自由基，避免細(xì)胞的氧化損傷。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）主要功能是促進(jìn)血管生長(zhǎng)，而對(duì)腰椎間盤(pán)突出的作用，目前研究尚未明確，可能與促進(jìn)血管因子的釋放，加快纖維軟骨的修復(fù)有關(guān)。

KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯主要作用通路涉及抗炎免疫反應(yīng)、細(xì)胞修復(fù)等復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路與炎癥及免疫反應(yīng)的發(fā)生關(guān)系密切，屬于促炎通路。在腰椎相關(guān)組織細(xì)胞的新陳代謝中，IL-17主要影響周?chē)装Y的產(chǎn)生及相關(guān)基質(zhì)的分解[25]。IL-17通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路，增強(qiáng)髓核細(xì)胞的細(xì)胞自噬能力。HIF-1信號(hào)通路是屬于低氧信號(hào)通路，主要由HIF-1α和HIF-1β2個(gè)亞單位組成。HIF-1α自身活性調(diào)節(jié)是乏氧應(yīng)答基因表達(dá)調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，調(diào)控主要發(fā)生在2條信號(hào)途徑：PI-3K/AKT依賴(lài)的HIF-1α蛋白穩(wěn)定性調(diào)控和MEK/MAPK介導(dǎo)的HIF-1α反式激活功能調(diào)控[26-28]。另外，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、血管緊張素、血小板衍生生長(zhǎng)因子等，可在非乏氧條件下影響HIF-1α的活性[29-30]。王惠等[31]發(fā)現(xiàn)杜仲腰痛丸（獨(dú)活寄生湯加減方）可通過(guò)抑制核因子κB信號(hào)通路的活化，調(diào)節(jié)IL-10、IL-1和TNF-α等水平的表達(dá)，抑制炎癥免疫反應(yīng)，減輕LDH患者的癥狀。戴宇祥等[32]研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH主要控制纖維環(huán)細(xì)胞中的p38MAPK磷酸化水平，減少I(mǎi)L-1等炎癥介質(zhì)的分化，減緩相應(yīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。以上研究與本研究所預(yù)測(cè)的作用通路不謀而合，證明了獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的藥靶蛋白模型的準(zhǔn)確性。

本研究通過(guò)分析獨(dú)活寄生湯干預(yù)LDH的有機(jī)成分及作用通路，確定了獨(dú)活寄生湯中藥復(fù)方的核心物質(zhì)，為L(zhǎng)DH的治療提供了理論依據(jù)。由于預(yù)測(cè)模型的局限性，本研究仍需進(jìn)行濕實(shí)驗(yàn)以證明此模型的真實(shí)有效性，為臨床醫(yī)師用藥提供方向，為中藥現(xiàn)代化提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。

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（2020-11-04收稿 責(zé)任編輯：張樂(lè)杰）