基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在機制

容偉明 袁長深 段 戡 梅其杰 郭錦榮 盧智賢

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530000；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨三科，廣西南寧 530023

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是一種代謝性疾病，體內(nèi)過多的尿酸可在滑液或軟骨中積聚并形成尿酸單鈉晶體，引起關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[1]，其是導(dǎo)致疼痛和致殘的主要疾病之一[2]，影響患者的生活質(zhì)量。隨著人們生活水平的提高，發(fā)病率也逐年上升[3]。雖然此病是良性疾病，但仍未得到充分治療。目前多使用非甾體類抗炎藥、秋水仙堿和皮質(zhì)類固醇激素等對癥治療，療效一般且副作用較大，由于西藥治療的局限性，迫切需要探索中藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的可行性[4]。

四妙散是由蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁四味中藥組成，在治療急性期的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中，可獲得較好的臨床效果[5-6]，但其潛在的作用機制尚未清楚。因此，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因和信號通路，為進一步明確四妙散對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 有效成分及其作用靶標(biāo)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）以“蒼術(shù)”“黃柏”“牛膝”“薏苡仁”為檢索詞分別檢索四妙散中四味中藥的化學(xué)成分，篩選出同時符合“口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%”和“類藥 性（drug likeness，DL）>0.18”的化合物，即為中藥的有效成分，并檢索出其作用的靶標(biāo)。

1.2 基因名的注釋

通過UniProt 數(shù)據(jù)庫注釋出靶標(biāo)相對應(yīng)的基因名，再利用Cytoscape 軟件建立藥物-有效成分-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病相關(guān)基因

在GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中以“gouty arthritis”為檢索詞篩選出與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因。

1.4 復(fù)方直接作用的靶基因

將篩出的四妙散作用靶標(biāo)和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因進行交集，相交的結(jié)果即為四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的直接靶基因。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

將靶基因?qū)隕nrichr 數(shù)據(jù)庫進行GO 和KEGG途徑富集分析，其中GO 包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；再利用R 軟件繪制富集分析的氣泡圖。

1.6 關(guān)鍵基因

使用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶基因交互系數(shù)為0.4的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，再通過Cytoscape 軟件中“cytohubba”插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選出關(guān)鍵基因。

1.7 藥物-基因-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更直觀地了解四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因和重要途徑，通過Cytoscape 構(gòu)建藥物-基因-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 有效成分

通過TCMSP 得到四妙散中65 個獨立的有效成分，其中蒼術(shù)9 個、黃柏37 個、牛膝20 個、薏苡仁9 個；有靶標(biāo)的有效成分是40 個。

2.2 有效成分-靶標(biāo)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

40 個有效成分可作用的靶標(biāo)共有197 個（圖1），通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析顯示，有效成分較為重要的是槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和漢黃芩素（wogonin），被作用最多的靶標(biāo)是PTGS2、PTGS1 和NCOA2。

圖1 藥物-有效成分-作用靶標(biāo)圖

2.3 復(fù)方直接作用的靶基因

與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的獨立基因215 個，再與四味藥作用靶標(biāo)交集得到27 個靶基因（圖2），其中四味藥物與疾病相關(guān)共有的基因3 個，三味藥物與疾病相關(guān)的基因10 個，兩味藥物與疾病相關(guān)的基因13 個，一味藥物與疾病相關(guān)的基因1 個。

圖2 藥物作用靶標(biāo)與疾病基因交集

2.4 富集分析

利用Enrichr 數(shù)據(jù)庫分析27 個靶基因，在P ＜0.05條件下，得到622 個GO 條目，其中BP 有551 個、MF有63 個和CC 有8 個，KEGG 途徑分析共有109 條信號通路。根據(jù)P 值選出BP、MF 前10 個顯著通路和KEGG 前30 條較為顯著的信號通路。BP 結(jié)果顯示靶基因顯著富集于細胞對細胞因子刺激的反應(yīng)和細胞因子介導(dǎo)的信號通路；MF 揭示靶基因在細胞因子活性和趨化因子活性中顯著富集；CC 顯示靶基因在富含ficolin-1 的顆粒內(nèi)腔和富含ficolin-1 的顆粒中較為豐富（圖3A～C，見封三）。KEGG 途徑富集分析結(jié)果顯示，靶基因在IL-17 信號通路、TNF 信號通路顯著富集（圖3D，見封三）。

圖3 GO 與KEGG 富集的氣泡圖

2.5 關(guān)鍵基因

靶基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)包括27 個節(jié)點和171 條關(guān)系邊數(shù)，再根據(jù)Degree 得分篩選出前10 位較為重要的基因，包括CXCL8、IL-6、PTGS2、CCL2、IL-1B、PPARG、IL-10、MMP9、MAPK1 和MMP2（圖4）；再結(jié)合藥物作用靶點與疾病相關(guān)基因的交集，可發(fā)現(xiàn)PTGS2、PPARG、CCL2、IL-6、CXCL8 等是四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因。

圖4 靶基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 有效成分-基因-通路網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建有效成分-基因-通路網(wǎng)絡(luò)，如圖5（見封四）所示，淺藍色圓圈代表關(guān)鍵基因，深藍色圓圈代表剩下的靶基因，紫色倒三角代表主要有效成分，綠色倒三角代表另外的有效成分，紅色正方形代表重要的信號通路。

圖5 有效成分-基因-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)的“痹癥”“歷節(jié)”“風(fēng)痹”等范疇。大部分學(xué)者認為濕、熱、瘀三者的相互作用主導(dǎo)著痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[7-8]，治療以清熱祛濕、祛瘀止痛為主；而方選四妙散切中其病機[5-6]。

本研究篩選到四妙散中40 個有效成分，其中槲皮素、山柰酚和漢黃芩素較為重要，均屬于黃酮類化合物，其中槲皮素能降低炎癥因子的水平起到抗炎作用[9]，但其不能降低血尿酸的含量[10]。山柰酚則可通過與嘌呤分解代謝中的關(guān)鍵酶-黃嘌呤氧化酶競爭性結(jié)合，減少尿酸的形成[11]。

為明確四妙散在治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎過程中主要的生物功能和信號通路，對復(fù)方可直接作用的靶基因進行富集分析及篩選發(fā)現(xiàn)其主要富集在細胞對細胞因子刺激的反應(yīng)、細胞因子介導(dǎo)的信號通路等生物學(xué)過程中和IL-17、TNF 信號通路中。研究發(fā)現(xiàn)，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血液中多種細胞因子的差異表達[12]，這可能是沉積的尿酸單晶體觸發(fā)促炎性細胞因子IL-1β的釋放，進而引起其他細胞因子的反應(yīng)導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[13]，因此通過降低IL-1β 的表達可明顯減輕炎癥反應(yīng)[14]。IL-17 信號通路主要是通過內(nèi)在的NF-κB 和MAPK通路來調(diào)節(jié)細胞中炎癥基因的表達進而控制炎癥[15]。IL-17 作為關(guān)鍵炎癥細胞因子，在急性痛風(fēng)性患者血清中呈高表達[16]，降低其含量可消腫和減少白細胞的浸潤，因此阻斷IL-17 信號通路是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一種新策略[17]。TNF 信號通路是在TNF-α 刺激下引起的途徑，其可激活NF-κB 并進一步促使炎癥的發(fā)生[18]。

最后分析可知PTGS2、PPARG、CCL2、IL-6、CXCL8等是四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因。PTGS2（即COX-2）在調(diào)節(jié)炎癥和緩解疼痛中發(fā)揮重要作用，是非甾體抗炎藥的治療目標(biāo)[19]，其在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中呈高表達，阻滯其表達可有效抑制炎癥的發(fā)生[20]。PPARG 是由PPARγ 編碼的基因，其可降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎滑膜中TNF-α 和IFN-γ 的表達而減輕炎癥反應(yīng)[21]。CCL2、IL-6 和CXCL8（即IL-8）是引起炎癥反應(yīng)重要因子；外周血中CCL2 的甲基化不足是導(dǎo)致痛風(fēng)的危險因素之一[22]，同時血清中IL-6、IL-8 及其他細胞因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展中發(fā)揮重要作用[23]。

本研究是通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，挖掘四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎可能的靶基因及信號通路，為進一步研究四妙散治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)，但其可能性仍需更多的實驗加以驗證。