FTA-ABS在電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)梅毒抗體低值標(biāo)本中的臨床應(yīng)用與研究

黃學(xué)東，應(yīng)姍珊，羅 嵐，李冬冬

四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科臨床微生物室，四川成都 610041

梅毒是由蒼白密螺旋體蒼白亞種引起的性傳播疾病，梅毒螺旋體可引起慢性全身性傳染疾?。黄渑R床癥狀呈多樣性，不同癥狀隨梅毒分期而表現(xiàn)不同[1-4]。目前，主要根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)史和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果對(duì)梅毒進(jìn)行診斷。常用的血清學(xué)檢測(cè)方法是梅毒螺旋體抗體檢測(cè)與非梅毒螺旋體抗體檢測(cè)[5]。近年來，化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)法檢測(cè)梅毒螺旋體的應(yīng)用較廣泛，但檢測(cè)中出現(xiàn)弱值或者低值結(jié)果時(shí)很難解釋。研究顯示CLIA 法結(jié)果出現(xiàn)COI低值時(shí)可能存在假陽性結(jié)果，解決此類問題主要采用梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)法進(jìn)行復(fù)核，TPPA法存在主觀因素，造成部分結(jié)果依然難以解釋，建議在TPPA法判讀結(jié)果有爭議時(shí)進(jìn)一步采用多種方法復(fù)檢[6-7]。因此，本文對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體COI低值的血清標(biāo)本，采用TPPA法復(fù)檢，對(duì)部分存在可疑結(jié)果或有爭議的標(biāo)本運(yùn)用熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(FTA-ABS)法再次檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2020年3-6月于四川大學(xué)華西醫(yī)院就診患者血清標(biāo)本，應(yīng)用Cobas e801電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有402份血清標(biāo)本梅毒螺旋體抗體COI低值(1≤COI<10)。經(jīng)TPPA法復(fù)檢，陽性345份，陰性37份和可疑(或保留)20份，從中選出陽性43份、陰性37份與可疑20份，COI低值血清標(biāo)本采用FTA-ABS法進(jìn)行IgG和IgM特異性抗體檢測(cè)。

1.2標(biāo)本采集 收集402例患者靜脈血，分離血清，采用ECLIA、TPPA法進(jìn)行梅毒螺旋體抗體檢測(cè)，剩余血清于-80 ℃冰箱保存。

1.3方法 所有試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。ECLIA法檢測(cè)由羅氏公司提供的Cobas e801化學(xué)發(fā)光儀及配套梅毒試劑盒進(jìn)行；TPPA法由日本富士瑞必歐株式會(huì)社提供的梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行；FTA-ABS法由歐盟實(shí)驗(yàn)診斷股份公司提供的熒光梅毒螺旋體抗體IgG/IgM檢測(cè)試劑盒及熒光顯微鏡配套系統(tǒng)進(jìn)行。

1.4結(jié)果判讀 TPPA法復(fù)檢方法：將血清稀釋液按100、25、25、25 μL依次加入1～4孔反應(yīng)板；再加入患者血清25 μL至第1孔，然后依次從上孔吸取25 μL加入下孔(從第1孔至第4孔)，第3孔加入25 μL未致敏粒子，第4孔加入25 μL致敏粒子；混勻后室溫水平靜置2 h后觀察結(jié)果并記錄。粒子成紐扣狀聚集，邊緣均勻平滑，判讀為陰性；粒子形成小環(huán)狀，邊緣均勻平滑，判讀為可疑；粒子明顯變大或邊緣不均勻且呈膜狀延展，判讀為陽性。

FTA-ABS法復(fù)檢方法：將患者血清進(jìn)行稀釋，滴加30 μL稀釋后血清至加樣板反應(yīng)區(qū)，將生物薄片載片蓋在加樣板凹槽里，18～25 ℃溫育30 min，用PBS-吐溫緩沖液清洗并振蕩浸洗5 min，滴加25 μL 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的熒光二抗至反應(yīng)區(qū)，再次溫育及浸洗，甘油封片，顯微鏡下判讀熒光模型。無熒光反應(yīng)，則判讀為陰性；吸收后的患者血清反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，加入熒光二抗，在顯微鏡下呈現(xiàn)蘋果綠色的熒光，則判讀為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；一致性檢驗(yàn)采用Kappa系數(shù)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1100份標(biāo)本FTA-ABS法的IgG/IgM檢測(cè)結(jié)果與TPPA法結(jié)果比較 在TPPA法IgG/IgM結(jié)果陽性43份、陰性37份、可疑20份ECLIA法和COI低值血清標(biāo)本中，F(xiàn)TA-ABS法IgG、IgM抗體檢測(cè)陽性率分別為63.00%、7.00%，其中FTA-ABS法IgM、IgG兩種抗體檢測(cè)同為陽性的血清標(biāo)本有6份，IgM單抗體陽性的血清標(biāo)本1份。因此，F(xiàn)TA-ABS IgG/IgM 檢測(cè)陽性率64.00%，與TPPA法結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TPPA法與FTA-ABS法結(jié)果一致性較差(Kappa=0.150)。見表1。

表1 FTA-ABS法IgG/IgM檢測(cè)結(jié)果與TPPA法比較[n(%)]

2.2ECLIA法梅毒螺旋體抗體結(jié)果COI為1～<5、5～<10時(shí)FTA-ABS法復(fù)檢結(jié)果與TPPA法復(fù)檢結(jié)果比較 當(dāng)1≤COI<5時(shí)，F(xiàn)TA-ABS法與TPPA法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體陽性率分別為63.51%、37.84%，兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，Kappa=0.160)。當(dāng)5≤COI<10時(shí)，F(xiàn)TA-ABS法和TPPA法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體陽性率分別為65.38%、57.69%，兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,Kappa=0.810)。見表2。

表2 FTA-ABS法與TPPA法梅毒螺旋體抗體在ECLIA法結(jié)果COI為1～<5、5～<10時(shí)復(fù)檢結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

梅毒主要通過性接觸傳播，且流行趨勢(shì)逐漸增加[8-9]。近幾年，特別是在老年人群中梅毒感染趨勢(shì)較明顯[10]，梅毒感染至今是敏感問題，影響社會(huì)穩(wěn)定及家庭和諧，因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)梅毒的技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。若發(fā)現(xiàn)梅毒結(jié)果假陽性或COI低值時(shí)，不及時(shí)進(jìn)行其他方法學(xué)復(fù)檢，易造成患者生理、心理、經(jīng)濟(jì)等負(fù)擔(dān)，增加醫(yī)療糾紛發(fā)生的概率[11]。梅毒螺旋體血清檢測(cè)方法結(jié)果可靠性尤為重要，是避免引起醫(yī)療糾紛的基石。

本文使用ECLIA法對(duì)臨床患者血清標(biāo)本進(jìn)行梅毒螺旋體抗體普篩，該方法具有靈敏度高、全自動(dòng)化、操作簡便、高通量、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，但存在一定數(shù)量的標(biāo)本假陽性；ECLIA法、TPPA法和FTA-ABS法3種方法均為梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)，但也存在不同之處。ECLIA法包被的抗原為生物素化的梅毒螺旋體特異性重組抗原(TpN17、TpN47、TpN15)，而TPPA法和FTA-ABS法包被的抗原為梅毒螺旋體(Nichols株)；這3種方法的檢測(cè)原理、檢測(cè)時(shí)間、自動(dòng)化程度、靈敏度、特異度也各不相同，如ECLIA法采用雙抗原夾心法，檢測(cè)時(shí)間較快(約18 min)，自動(dòng)化程度高(Cobas的前處理流水線)，操作步驟簡單，靈敏度高；而TPPA法與FTA-ABS法分別采用間接凝集法、間接法，二者檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長，自動(dòng)化程度不高，相對(duì)ECLIA法操作步驟復(fù)雜，但二者檢測(cè)方法的特異度高，能更好地作為補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，排查梅毒感染。因此，本研究對(duì)2020年3月1日至6月30日來本院就診患者通過ECLIA法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并收集COI低值(1≤COI<10)標(biāo)本共402份。將402份ECLIA法檢測(cè)結(jié)果低值血清標(biāo)本進(jìn)行TPPA法復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果顯示20份結(jié)果可疑，37份結(jié)果陰性與ECLIA法結(jié)果不符，其臨床診斷為腫瘤、顱腦感染、急性炎癥等，有相關(guān)研究顯示某些疾病如腦部病變和腫瘤會(huì)引起梅毒生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果假陽性[12]。

對(duì)于ECLIA法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體是否存在假陽性或TPPA法結(jié)果可疑的血清標(biāo)本是否真陽性，還需進(jìn)一步證實(shí)。所以將實(shí)驗(yàn)中TPPA法結(jié)果中可疑20份、陰性37份及陽性43份血清標(biāo)本采用FTA-ABS法IgG和IgM特異性抗體檢測(cè)。FTA-ABS法結(jié)果顯示64份陽性，與TPPA法結(jié)果不一致，F(xiàn)TA-ABS法陽性檢出率高于TPPA法，可能與TPPA法的檢測(cè)方式有關(guān)，TPPA法檢測(cè)梅毒螺旋體總抗體，無法分辨特異性IgG抗體和IgM抗體，無法區(qū)分現(xiàn)癥感染或既往感染[13]。本研究FTA-ABS法結(jié)果中有6份IgG和IgM抗體均檢測(cè)為陽性，提示可能正在進(jìn)行梅毒治療或治療梅毒不徹底；1份IgM抗體陽性，IgM抗體是梅毒活動(dòng)性的血清學(xué)指標(biāo)，提示可能患者是初期感染或患者因免疫力低下導(dǎo)致IgM抗體再次升高[14-15]。為更加清楚了解FTA-ABS法與TPPA法在ECLIA法1≤COI<10區(qū)間是怎樣的檢出分布情況，分別將1≤COI<5和5≤COI<10區(qū)間值作為診斷界值進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，1≤COI<5時(shí)二者方法存在差異性，5≤COI<10時(shí)二者方法不存在差異性。因此，本文將TPPA和FTA-ABS兩種方法進(jìn)行聯(lián)用復(fù)檢，特別是在TPPA法結(jié)果可疑及ECLIA法1≤COI<5時(shí)，兩種方法互相補(bǔ)充，極大提高了臨床檢測(cè)效果。筆者認(rèn)為，在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下，ECLIA法檢測(cè)出現(xiàn)陽性低值時(shí)，應(yīng)選用多種梅毒螺旋體抗體血清學(xué)方法進(jìn)行復(fù)檢，雖各種檢測(cè)方法都存在假陽性，但只要正確運(yùn)用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及梅毒診療指南指導(dǎo)方法，制訂好實(shí)驗(yàn)室相關(guān)操作流程，就能出具可靠、準(zhǔn)確的梅毒螺旋體抗體血清學(xué)結(jié)果，且能有效減輕患者心理壓力，避免醫(yī)療糾紛產(chǎn)生。但需要特別注意的是，除梅毒檢測(cè)的技術(shù)性因素之外，流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)對(duì)于梅毒的診斷更為重要。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)ECLIA法5≤COI<10時(shí)，TPPA法與FTA-ABS法檢測(cè)結(jié)果一致性強(qiáng)，說明在ECLIA法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體出現(xiàn)低值時(shí)，COI≥5的低值血清標(biāo)本使用以上兩者方法進(jìn)行復(fù)檢均可以滿足臨床檢測(cè)要求；但當(dāng)1≤COI<5時(shí)，兩種方法一致性差，若存在可疑標(biāo)本爭議，運(yùn)用TPPA法復(fù)檢后，應(yīng)建立第二種方法再次復(fù)檢，以此提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)梅毒螺旋體抗體的靈敏度和特異度，提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。