肉蓯蓉苯乙醇苷對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

齊鑫鑫，由淑萍，何轉(zhuǎn)霞，趙 軍，劉 濤

（1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；2新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院；烏魯木齊 830011；3新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004）

肝癌在全球都是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2018年，肝癌發(fā)病率在全球癌癥發(fā)病率中排第6 位，死亡率在全球癌癥相關(guān)死亡率中排第2位，其中超過(guò)一半的新發(fā)病例和死亡病例在中國(guó)[1]。傳統(tǒng)的肝癌治療方法存在許多局限，與化療藥物相比，天然藥物因具有溫和、毒副作用小、無(wú)耐藥性的特點(diǎn)，能有效改善患者癥狀，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)腫瘤患者生存期等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而逐漸得到廣泛研究與應(yīng)用。

肉蓯蓉（Cistache deserticola）是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴補(bǔ)益類中藥，自古就有“沙漠人參”的美譽(yù)。近年來(lái)，肉蓯蓉以其顯著的生物活性備受人們關(guān)注。其化學(xué)及藥理作用研究顯示，苯乙醇苷是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，其單體松果菊苷可通過(guò)降低氧化損傷、減輕肝脂肪病變來(lái)預(yù)防酒精引起的肝損傷[3]，而類葉升麻苷可有效預(yù)防肝細(xì)胞癌的發(fā)生[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)類葉升麻苷可有效減緩酒精性肝損傷中的炎癥反應(yīng)[5]；此外，CPhGs、松果菊苷與毛蕊花糖苷均具有良好的抗纖維化作用[6-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)CPhGs 調(diào)控HepG2 肝癌細(xì)胞增殖、凋亡防治肝癌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步充實(shí)CPhGs在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HepG2 肝癌細(xì)胞株（貨號(hào)：ZQ0022，上海中橋新舟生物科技有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 肉蓯蓉苯乙醇苷（CPhGs，含松果菊苷≥35%，毛蕊花糖苷≥16%；批號(hào)：20180502，和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司）；MEM 不完全培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；胎牛血清（批號(hào)：1928702）、谷氨酰胺（批號(hào)：1941832）、丙酮酸鈉（批號(hào)：1916979）；雙抗（青霉素與鏈霉素）、細(xì)胞凋亡試劑盒與細(xì)胞周期試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；四甲基偶氮唑鹽MTT（批號(hào)：EZ5679C133）、二甲基亞砜（DMSO與Hoechst33258（美國(guó)Sigma公司）。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(tái)與全管波長(zhǎng)自動(dòng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢驗(yàn)測(cè)試儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（英國(guó)NEW BRUNSWICK Galaxy 系列）；CK-40 影型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；AEL-200 型電子天平；TGL-16G 型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)；低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HepG2 肝癌細(xì)胞用MEM 完全培養(yǎng)基（含10%FBS、1% 雙抗、1% 谷氨酰胺、1% 丙酮酸鈉），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4 組：空白對(duì)照組（完全培養(yǎng)基）、CPhGs 低、中、高劑量組（含不同濃度CPhGs的完全培養(yǎng)基），并使用相差倒置顯微鏡拍照，觀察不同濃度CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)HepG2 細(xì)胞增殖抑制的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/孔，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含0、78、110、125、150、170、188、220、375、500μg/mL CPhGs 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加MTT 溶液處理4 h，再加入DMSO 避光孵育10 min，然后用酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)吸光度值（OD 值）。計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制率（IC50）并設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)劑量。抑制率=[（空白對(duì)照組OD 值－實(shí)驗(yàn)組OD 值）/空白對(duì)照組OD值]×100%]。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察CPhGs 對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞克隆率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2000 個(gè)/孔的細(xì)胞密度均勻的鋪至六孔板中，細(xì)胞貼壁后，換含不同濃度的CPhGs完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。7 d后，棄上清，PBS 洗滌2次，加入1 mL 4% 組織固定液固定30 min。30 min 后，棄去組織固定液，加入1 mL 結(jié)晶紫，染色30 min，然后再用PBS洗滌細(xì)胞2次，室溫晾干拍照。

1.2.4 倒置顯微鏡拍照觀察CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入含0、32、64、128 μg/mL CPhGs 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，在倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.2.5 Hoechest33258 檢測(cè)CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞 核 的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種至4分格玻底皿中，細(xì)胞分組處理同“1.2.4”實(shí)驗(yàn)。 待細(xì)胞處理24 h 后，收集細(xì)胞用Hoechst33258 稀釋液染色15 min，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核損傷情況。

1.2.6 線粒體染色檢測(cè)CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞線粒體的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種至4分格玻底皿中，細(xì)胞分組處理同“1.2.4”實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞處理24 h 后，收集細(xì)胞用線粒體染劑染色15 min，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體損傷的發(fā)生情況。

1.2.7 AnnexinV-FITC1PI雙染法觀察CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入含0、32、64、128 μg/mL CPhGs 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明逐步處理細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響 HepG2 細(xì)胞按“1.2.4”步驟接種至6 孔板中，細(xì)胞分組處理同“1.2.4”實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞處理24 h 后，收集細(xì)胞用預(yù)冷的75% 乙醇中固定過(guò)夜，次日洗滌并收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書逐步處理細(xì)胞，然后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.9 Western-blot 檢測(cè)不同濃度CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Cleaved?Caspase3 及PARP 表達(dá)的影響 HepG2 細(xì)胞按“1.2.4”步驟接種至6 孔板中，細(xì)胞分組處理同“1.2.4”實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞處理24 h 后，收集蛋白進(jìn)行定量并使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量大小配置12%、10% 的分離膠及5% 的濃縮膠，每個(gè)樣品按等質(zhì)量上樣，恒壓電泳，恒流轉(zhuǎn)膜，5% 的脫脂牛奶室溫封閉2 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，室溫孵育二抗1 h，曝光拍照，并用image J進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用隨著CPhGs 藥物濃度的增加，CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制逐漸增加，當(dāng)CPhGs 藥物濃度為500 μg/mL 時(shí)，抑制率為（82±2.3）%，經(jīng)過(guò)probit 分析，CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞的IC50為187 μg/mL，見(jiàn)圖1。在24、48、72 h 干預(yù)后，與空白對(duì)照組比較，CPhGs各劑量組OD值均顯著降低，抑制率均顯著增高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；干預(yù)24 h 后，CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制具有一定的劑量依賴性（P<0.01）。同時(shí)，比較CPhGs 各劑量組在3 個(gè)時(shí)間段的抑制率發(fā)現(xiàn)，CPhGs中、高劑量組，3 個(gè)時(shí)間段HepG2 細(xì)胞抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

圖1 CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50

表1 CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s，n=3）

表1 CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與低劑量組比，#P<0.01；與中劑量比，&P<0.01；與中劑量比較，&&P<0.05；與24 h 比較，aP<0.01；與48 h比較，bP<0.01

分組空白對(duì)照組CPhGs低劑量組CPhGs中劑量組CPhGs高劑量組劑量/(μg/mL)0 32 64 128 24 h吸光度值1.00±0.08 0.91±0.07*0.69±0.01*#0.62±0.01*#&&抑制率/%-9.19±6.50 37.23±1.92 37.65±0.81 48 h吸光度值1.06±0.02 0.89±0.01*0.64±0.03*#0.54±0.01*#&a抑制率/%-10.15±0.60 35.90±3.11 43.72±1.29 72 h吸光度值1.02±0.05 0.86±0.02*&0.57±0.05*#ab 0.47±0.06*#& ab抑制率/%-13.77±0.80 41.62±4.72 52.05±6.02

2.2 不同濃度CPhGs 對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞克隆率的影響隨著CPhGs 藥物濃度的增加，細(xì)胞克隆形成能力逐漸降低，當(dāng)CPhGs 為64 μg/m 與128 μg/mL 時(shí)，HepG2肝癌細(xì)胞的克隆形成能力降低為對(duì)照組的7%與1%（P<0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞平板克隆率的影響

2.3 從形態(tài)學(xué)觀察不同濃度CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響在不同濃度CPhGs 處理組中，HepG2 細(xì)胞隨著藥物濃度增高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞出現(xiàn)空泡，細(xì)胞折光度下降，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間連接疏松，細(xì)胞輪廓發(fā)生改變。CPhGs 各劑量組干預(yù)24 h后，細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核碎裂、核邊集的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且細(xì)胞核發(fā)出的藍(lán)色強(qiáng)光較空白對(duì)照組強(qiáng)。線粒體染色發(fā)現(xiàn)，CPhGs各劑量組細(xì)胞發(fā)生線粒體腫脹、碎片化、數(shù)量以及熒光強(qiáng)度都發(fā)生改變，且隨著CPhGs劑量的增加，線粒體損傷特征也越來(lái)越明顯。此外，還可以看出，CPhGs 高劑量組的細(xì)胞數(shù)量下降明顯，細(xì)胞皺縮。除了細(xì)胞核與線粒體發(fā)生明顯改變外，細(xì)胞邊界不清，處于即將崩裂、死亡的狀態(tài)。

圖3 不同濃度CPhGs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察（600×）

2.4 不同濃度CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡率的影響CPhGs 各劑量組（32、64、128 μg/mL）作用HepG2細(xì)胞24 h 后，各組細(xì)胞均發(fā)生了細(xì)胞凋亡，且隨著CPhGs濃度增加而增加：空白組凋亡率（早期＋晚期）為（7＋1.18）%，CPhGs 低劑量組凋亡率為（11.2＋0.1）%，CPhGs 中劑量組凋亡率為（19.5＋2.94）%，CPhGs 高劑量組凋亡率為（69.3＋3.35）%。與空白對(duì)照組比較，CPhGs 中、高劑量組的早期凋亡率與總凋亡率均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性（P<0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

2.5 不同濃度CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響G1 期與G2/M 期細(xì)胞比例，與空白對(duì)照組比較，CPhGs 各劑量組均出現(xiàn)顯著降低（P<0.01）；而S 期細(xì)胞比例，與空白對(duì)照組比較，GPhGs 各劑量組均出現(xiàn)明顯增加（P<0.01）。此外，CPhGs 各劑量組之間比較，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2，圖5。

表2 不同濃度CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

表2 不同濃度CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

分組空白對(duì)照組CPhGs低劑組CPhGs中劑組CPhGs高劑組劑量/(μg/mL)0 32 64 128細(xì)胞周期G1/G0 67.10±2.70 62.24±2.89 56.40±2.81*#43.93±3.49*#&G2/M 8.97±0.58 6.01±0.83*3.31±0.59*#2.80±1.56*#&S 23.93±2.15 31.76±2.76*40.29±2.23*#53.25±3.73*#&

圖5 不同濃度CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

2.6 不同濃度CPhGs 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Cleaved - Caspase3 及PARP表達(dá)的影響CPhGs 各劑量組凋亡蛋白Cleaved?Caspase3表達(dá)均增加，與空白對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且各劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。 CPhGs 中、高劑量組凋亡蛋白PARP表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01 或P<0.05）；且各劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01 或P<0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 不同濃度CPhGs對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Cleaved-Caspase3及PARP表達(dá)的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡作為一種潛在的抗癌機(jī)制，一直受到研究人員的密切關(guān)注。大量證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡是腫瘤發(fā)展與治療的重要機(jī)制[8-9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CPhGs可抑制HepG2 肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)還能將細(xì)胞周期阻滯在S 期。眾所周知，真核生物通過(guò)無(wú)限的有絲分裂進(jìn)行生長(zhǎng)增殖，因此，就形成了有規(guī)律細(xì)胞周期，細(xì)胞周期分成G1 期、S期、G2 期及M 期4 個(gè)階段。研究表明，S 期阻滯是誘導(dǎo)凋亡的潛在機(jī)制[10]，例如：抗壞血酸可誘導(dǎo)腸道細(xì)胞S 期的DNA 損傷，從而激活下游凋亡相關(guān)蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡[11]?；倍▔A可通過(guò)阻滯S 期激活JNK 與ERK通路，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡[12]。盡管，真核生物有絲分裂及DNA復(fù)制取得很多進(jìn)展，但在DNA損傷或細(xì)胞周期阻滯觸發(fā)細(xì)胞死亡的事件還有待進(jìn)一步研究。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPhGs可通過(guò)下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Cleaved?Caspase3 及PARP 凋亡蛋白來(lái)誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡。B 細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因家族成員在調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡中起著核心作用，Bcl-2蛋白的增加可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此它的降低也可理解為促凋亡[13]。凋亡蛋白Cleaved?Caspase3 是內(nèi)在線粒體凋亡途徑與外在死亡受體途徑的交匯點(diǎn)，是凋亡的主要執(zhí)行者[14]，在凋亡啟動(dòng)時(shí)剪切其底物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）從而引發(fā)凋亡的發(fā)生，變構(gòu)的PARP 又可激發(fā)其他Caspase 家族蛋白水解，以確保凋亡的順利進(jìn)行[15]。 有研究表明，Cleaved ? Caspase3 可作為癌癥治療的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)[16]，而在本實(shí)驗(yàn)中，CPhGs 各劑量組均能促進(jìn)HepG2 細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，Hochest33258 染色發(fā)現(xiàn)CPhGs 低劑量組即可見(jiàn)輕微的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是一種依賴蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，它主要存在兩種相互交錯(cuò)的途徑：外在死亡受體途徑和內(nèi)在線粒體途徑[17]，此外，還包含一些非經(jīng)典途徑，這些細(xì)胞凋亡途徑大都依賴Caspase 介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。確定CPhGs 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方式還需通過(guò)其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行綜合判斷。

目前，天然藥物與腫瘤治療的相關(guān)研究頗多，機(jī)制也復(fù)雜多樣。因此，深入探討CPhGs 抑制HepG2細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的具體分子學(xué)機(jī)制尤為重要，這為探討防治肝癌的分子機(jī)制及肉蓯蓉藥物抗肝癌的研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為新疆管花肉蓯蓉藥物的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。