玫瑰黃酮提取物對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平和抗氧化作用的研究

魏志勇，阿衣古麗·麥麥提，海熱姑麗·馬木提，阿依考賽爾·亞力坤，景玉霞

（1新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)奎屯中醫(yī)院，奎屯 833200;2 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011;3新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院，烏魯木齊 830002）

高血脂、高血糖、高血壓一直以來都是全世界關(guān)注的焦點(diǎn)，而且隨著生活水平提高、工作壓力不斷增加，三高已經(jīng)越來越年輕化，由此引發(fā)的并發(fā)癥及其死亡人數(shù)也是越來越多。對(duì)于高脂血癥目前除了加強(qiáng)鍛煉和控制飲食就是依靠藥物，而可以有效降低血脂水平且不良反應(yīng)小的藥物還很匱乏。玫瑰花含多酚類、黃酮等多種成分，其含有的黃酮成分具有清除自由基、降血糖、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)、防治血管硬化等多種功效[1-3]，有良好的藥用價(jià)值，其作用可能與抗氧化作用有關(guān)。目前，對(duì)于玫瑰黃酮的研究主要集中在玫瑰花中黃酮化合物的提取以及降糖作用的研究[4-6]。據(jù)報(bào)道，玫瑰花總黃酮（RFE）具有清除氧自由基的能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率呈線性關(guān)系[7-8]。SOD、MDA、GSH-Px 的聯(lián)合測(cè)定可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力，說明機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力[9]。但很少有研究對(duì)玫瑰黃酮提取物在高脂血癥模型中的抗氧化作用從SOD、MDA、GSH-Px 角度作進(jìn)一步研究，本研究制備大鼠高脂血癥模型，觀察玫瑰黃酮提取物對(duì)高脂血癥的抗氧化作用，為玫瑰黃酮治療高脂血癥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，體重（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(新)2018-0003。所有SD 大鼠均在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心按照國際AAALAC 標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一管理，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與使用管理委員會(huì)審核。SD 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將60 只大鼠隨機(jī)分為6 組：對(duì)照組、模型組、陽性藥物組及玫瑰黃酮提取物低劑量組(RFE-L 組, 6 mg/kg)、中劑量組(RFE-M, 12 mg/kg)、高劑量組(RFE-H組, 24 mg/kg)，每組10只。

1.2 試劑及儀器高脂飼料（83% 基礎(chǔ)飼料、10% 豬油、6% 白砂糖、1% 膽固醇）；95% 的玫瑰黃酮提取物（贛州華漢生物科技有限公司，90106-38-0）；甘油三酯試劑盒（深圳庫貝爾，190401）；膽固醇試劑盒（深圳庫貝爾，190501）；高密度脂蛋白試劑盒（深圳庫貝爾，190501）；低密度脂蛋白試劑盒（深圳庫貝爾，190601）蘇木素染料、伊紅染料（北京索萊寶科技有限公司）；病理染色常規(guī)試劑；SOD 試劑盒（E-30266，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；MDA 試劑盒（E-30265，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；GSH-Px 試劑盒（E-31036，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；石蠟切片機(jī)（德國Leica）；圖像采集系統(tǒng)（德國Leica）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；酶標(biāo)儀(Thermo 公司)；生化儀（深圳庫貝爾，iMagic-V7）。

1.3 動(dòng)物模型制作對(duì)照組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，自由采食飲水，制作高脂血癥動(dòng)物模型。喂養(yǎng)8 w 后，對(duì)照組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，其余組均以高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)給予藥物干預(yù)：對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)，其余各組仍然高脂飼料喂養(yǎng)；陽性藥物組給予4 mg/kg體質(zhì)量辛伐他汀灌胃，95% 的玫瑰黃酮提取物按RFE-L 組(RFE-L 組, 6 mg/kg)、中劑量組(RFE-M 組, 12 mg/kg)、高劑量組(RFEH 組, 24 mg/kg)灌胃，模型組和對(duì)照組給予同等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)1個(gè)月。

1.4 血脂水平測(cè)定藥物干預(yù)結(jié)束后，處死各組大鼠，取全血，全血靜置約1 h，3000 r/min，離心5 min，吸取血清用生化儀檢測(cè)TG、TC、HDL、LDL。

1.5 肝臟病理HE 染色藥物干預(yù)結(jié)束后，處死大鼠，取肝臟，固定于4 %福爾馬林中，48 h 后，固定好的肝臟經(jīng)修整，脫水，包埋，切片，進(jìn)行HE染色。

1.6 檢測(cè)SOD、MDA、GSH-Px 的表達(dá)水平藥物干預(yù)結(jié)束后，處死各組大鼠，取全血，全血靜置約1 h，3000 r/min，離心5 min，吸取血清用于試劑盒檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清SOD、MDA、GSH-Px中水平，方法嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠成模率對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，到第8周內(nèi)眥靜脈取血用于檢測(cè)血脂水平，除去12只大鼠血脂升高不明顯，其余各組和對(duì)照組比較TC、TG、HDL-C、LDL-C差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1，各組經(jīng)血脂水平測(cè)定后，篩選出成模動(dòng)物，經(jīng)測(cè)算平均成模率達(dá)到約76%，詳見表2。

表1 高脂血癥模型大鼠血脂表達(dá)水平（±s，mmol /L）

表1 高脂血癥模型大鼠血脂表達(dá)水平（±s，mmol /L）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別對(duì)照組模型組tP只數(shù)10 38 TC 1.47±0.62 4.43±0.73*-11.739<0.01 TG 0.54±0.16 0.99±0.21*-4.894<0.01 HDL-C 0.89±0.13 0.54±0.17*5.811<0.01 LDL-C 0.45±0.11 0.98±0.21*-7.049<0.01

表2 各組動(dòng)物制成高脂血癥模型成模率

2.2 各組大鼠不同組藥物干預(yù)后肝臟的病理改變對(duì)照組大鼠肝組織無病理改變，有正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝索排列整齊，肝細(xì)胞呈放射狀圍繞中央靜脈排列，細(xì)胞大小正常。模型組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，顯微鏡下可見大量的脂肪空泡，肝細(xì)胞排列不規(guī)則；陽性對(duì)照組中肝小葉結(jié)構(gòu)正常，高倍鏡下仍可見少量脂肪空泡，肝索排列整齊；玫瑰黃酮提取物RFE-L 組可見肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞有大量的脂肪空泡，肝細(xì)胞排列不規(guī)則；玫瑰黃酮提取物中劑量組可見肝小葉結(jié)構(gòu)已經(jīng)有所恢復(fù)，部分視野可見完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝索排列整齊，但是仍可見較多肝細(xì)胞變性，整個(gè)視野有較多脂肪空泡；玫瑰黃酮提取物高劑量組可見肝小葉結(jié)構(gòu)已經(jīng)恢復(fù)較好，肝索排列整齊，肝細(xì)胞少見脂肪變性，細(xì)胞大小形態(tài)正常。各組大鼠肝組織病理改變見圖1。

2.3 各組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)后血脂水平的改變與對(duì)照組比較，模型組TC、TG、LDL-C 顯著升高，HDL-C顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性藥物組、RFE-L、RFE-M、RFE-H 中大鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與陽性藥物組比較，RFEL、RFE-M 組TC 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與RFE-H 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與RFE-L 組TG 比較，RFE-M、RFE-H 組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與RFE-H 組LDL-C 比較，與RFE-L、RFEM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 玫瑰黃銅提取物對(duì)高血脂大鼠血清中血脂水平的影響（±s，mmol /L）

表3 玫瑰黃銅提取物對(duì)高血脂大鼠血清中血脂水平的影響（±s，mmol /L）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05;與陽性藥物組比較，△P<0.05

組別對(duì)照組模型組陽性藥物組RFE-L組RFE-M組RFE-H組FP動(dòng)物數(shù)/只10 8 7 8 8 7 TC 1.846±0.57#△5.40±0.93*△3.22±0.805#4.68±0.68△4.29±0.77#△2.75±0.56#28.643<0.01 TG 0.54±0.13#1.18±0.25*△0.52±0.11#0.83±0.14*#△0.62±0.13#0.51±0.12#23.244<0.01 HDL-C 0.72±0.14#0.39±0.13*0.48±0.11#0.53±0.10#0.57±0.13#0.52±0.12#7.208<0.05 LDL-C 0.51±0.15#△1.17±0.33*#△0.82±0.16*#0.98±0.18*#0.72±0.14*#0.48±0.10#△15.833<0.01

2.4 各組大鼠的SOD、MDA、GSH-Px 改變不同組SOD、MDA、GSH-Px 的改變不同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步采用L-SD 法進(jìn)行兩兩比較，SOD 結(jié)果表明:與對(duì)照組比較，陽性藥物、RFE-M、RFE-H 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥物、RFE-M、RFE-H 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與RFE-L 比較，RFE-M、RFE-H 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著玫瑰黃酮提取物藥物濃度增加，SOD 水平逐漸升高。MDA 結(jié)果表明:與對(duì)照組比較，模型、RFE-L、RFE-M 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，其余組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽性藥物組和RFE-H 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著玫瑰黃酮提取物藥物濃度增加，MDA 水平逐漸降低。GSH-Px 結(jié)果表明:與對(duì)照組比較，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽性藥物、RFE-M、RFE-H 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與RFE-L 組比較，RFE-M、RFEH組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 各組動(dòng)物SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組動(dòng)物SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性藥物組比較，△P<0.05；與RFE-L組比較，▼P<0.05

組別對(duì)照組模型組陽性藥物組RFE-L組RFE-M組RFE-H組FP SOD/（pg/mL）3.89±0.91△3.24±0.61△6.70±1.5*#4.06±0.49△5.68±0.78*#△▼6.34±1.07*#▼22.196 0.001 MDA/(nmol/L)0.21±0.08#0.99±0.30*△0.16±0.09#0.79±0.17*#△0.53±0.09*#△▼0.16±0.10#▼49.143 0.001 GSH/(pmol/mL)10.47±2.00#△4.09±1.53*△7.96±1.54*#5.33±1.51*△6.89±1.19*#▼8.65±1.92*#▼19.713 0.001

3 討論

隨著人們生活水平不斷提高，攝入越來越多的高脂高糖飲食，高脂血癥、糖尿病、冠心病的發(fā)病率年輕化。盡管臨床已經(jīng)有成熟應(yīng)用于臨床的降脂降糖藥物，但是這些藥物在發(fā)揮作用時(shí)，有不同程度的肝腎功能損傷。因此亟需尋找既能發(fā)揮降低血脂水平又能降低血糖水平的藥物。據(jù)報(bào)道，玫瑰花中含有的黃酮成份具有降血脂、降糖、抗菌、抗炎和鎮(zhèn)痛等生物活性作用[10-13]。因此本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)玫瑰黃酮提取物對(duì)高脂血癥大鼠的降脂作用及其抗氧化作用展開研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮類化合物有降低血脂的作用[14-15]。篩選出的符合高脂血癥要求的模型動(dòng)物，經(jīng)不同濃度藥物連續(xù)灌胃一個(gè)月后取得樣本，結(jié)果顯示玫瑰黃酮提取物低、中、高組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高，且玫瑰黃銅提取物RFE-H 組降脂作用最好，說明玫瑰黃銅提取物低、中、高劑量組均有不同程度降低血脂的功能，且降脂作用與給藥濃度成正比，呈劑量依賴關(guān)系[16]。

本實(shí)驗(yàn)中高脂血癥模型組的病理改變與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，對(duì)照組大鼠肝組織無病理改變，而模型組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，顯微鏡下可見大量的脂肪空泡，這是高脂血癥動(dòng)物模型最主要的病理特征。經(jīng)藥物干預(yù)后的動(dòng)物模型病理改變明顯好轉(zhuǎn)，而且隨著給藥濃度的增加，脂肪空泡越來越少，并且肝細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常形態(tài)和大小，肝小葉結(jié)構(gòu)也逐漸恢復(fù)，以玫瑰黃酮提取物RFE-H組HE染色與對(duì)照組及陽性藥物組比較，差異最小，說明玫瑰黃酮提取物RFE-H 組有利于修復(fù)高脂飼料造成動(dòng)物的肝細(xì)胞損傷。

玫瑰花總黃酮具有清除自由基，抑制產(chǎn)生活性氧，從而減少氧化應(yīng)激[18]。SOD、MDA 和GSH-Px 聯(lián)合測(cè)定，可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力，說明機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力[19]。SOD 是抗氧化體系中最關(guān)鍵的酶，能夠清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞[20]，成模動(dòng)物經(jīng)過玫瑰黃酮提取物灌胃治療后，隨著干預(yù)藥物濃度的增加，SOD 水平不斷增加，說明玫瑰黃酮提取物在一定程度上發(fā)揮了抗氧化作用，且隨著藥物濃度的增加，其作用逐漸增強(qiáng)。MDA 產(chǎn)生的量與氧自由基的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度[21-22]。本研究中MDA 在模型組中表達(dá)最高，說明模型組中的肝細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，這與病理結(jié)果一致，隨著玫瑰黃酮提取物藥物濃度的增加，MDA 水平逐漸降低，說明玫瑰黃酮提取物的藥物劑量與MDA 表達(dá)呈反向趨勢(shì)，模型損傷程度與MDA呈正向趨勢(shì)。GSH-Px 是體內(nèi)重要的催化過氧化氫分解的酶，將其還原成無害的羥基化合物和水，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜及細(xì)胞功能的作用，與SOD 的作用趨勢(shì)一致[23]。GSH-Px在本實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，隨著干預(yù)藥物濃度的增加GSH-Px 水平不斷增加，說明玫瑰黃酮提取物可能分解了氧自由基，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化作用，且隨著藥物濃度的增加，其作用逐漸增強(qiáng)。本研究顯示，玫瑰黃酮提取物RFE-H 組的SOD和GSH-Px 明顯高于模型組，而MDA 遠(yuǎn)低于模型組，表明RFE-H 組可能是清除了機(jī)體內(nèi)氧自由基，使機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度顯著降低，增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化作用，說明高劑量的玫瑰黃酮提取物的降血脂作用可能與機(jī)體的抗氧化酶活性有關(guān)。

綜上，玫瑰黃酮提取物的降血脂作用可能與機(jī)體的抗氧化酶活性有關(guān)，且與玫瑰黃酮提取物呈劑量依賴性。