紫草素對肺炎鏈球菌引起的肺炎小鼠細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/p38絲裂素活化蛋白激酶/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣蛋白3信號通路及肺血管通透性的影響

衛(wèi)麗，劉虹，閆鮮鵬

肺炎鏈球菌是一種革蘭陽性雙球菌，是引起腦膜炎、社區(qū)獲得性肺炎等炎癥性疾病的主要病原體。研究報道，每年約有160 萬人死于肺炎鏈球菌性肺炎，危害嚴(yán)重。目前臨床治療肺炎鏈球菌性肺炎仍主要以抗生素為主，但萬古霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類等耐藥菌株的出現(xiàn)正嚴(yán)重影響肺炎鏈球菌性肺炎的治療效果，因此急需尋找非抗生素類有效替代藥品。紫草素是一種由草本植物紫草根部提取的萘醌化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性。絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路是細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥及應(yīng)激等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯通路之一，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）、p38 MAPK（p38）屬MAPK 兩個不同亞族，近來研究發(fā)現(xiàn)，ERK 和p38信號通路是介導(dǎo)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子，而紫草素可通過抑制p38 通路抑制肺纖維細(xì)胞增殖和活化。另核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受 體 蛋 白3（nucleotide binding oligomerization do?main like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體在機(jī)體固有免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中起重要作用，可參與急性肺損傷。但關(guān)于紫草素對肺炎鏈球菌性肺炎肺血管通透性及ERK/p38/NLRP3 信號通路的影響尚鮮有研究，因此本研究2020 年1―5 月通過建立肺炎鏈球菌性肺炎小鼠模型，探究紫草素對其肺血管通透性及ERK/p38/NLRP3 信號通路的影響，以期揭示其作用機(jī)制，為臨床肺炎鏈球菌性肺炎治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 周齡SPF 級雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量16～18 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0002。本研究經(jīng)陜西省人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)通過，符合動物使用指南。

1.2 主要試劑及儀器

紫草素（貨號S7576，HPLC≥98%）購自Sigma-Aldrich 公司；頭孢呋辛酯（批號H20000399）購自廣東立國制藥有限公司；肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49619 購自廣東微生物菌種保藏中心。RNA 提取試劑盒（貨號R0011）、BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0010S）均購自上海碧云天生物科技有限公司；PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Syn?thesis Kit（貨號6210A）、TB Green? Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（貨號RR820A）均購自TaKaRa公司；引物由華大基因合成；小鼠腫瘤壞死因子（tu?mor necrosis factor，TNF）-α ELISA 試劑盒（貨號MM-0132M2）購自南通飛宇生物科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β ELISA 試劑盒（貨號ZC-37974）購自上海茁彩生物科技有限公司；兔源一抗anti-ERK1/2（貨號76299）、anti-p38（貨號ab170099）、an?ti-p-p38（貨號ab4822）、anti-NLRP3 抗體（貨號ab214185）、anti-GAPDH 抗體（貨號ab9485）、二抗羊抗兔IgG（貨號ab6721）均購自英國Abcam 公司。Evolution 220 紫外分光光度計、FC 型酶標(biāo)儀、ABI 7500 RT-qPCR儀均購自美國Thermo Fisher公司等。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組

BALB/c 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，進(jìn)行乙醚輕度麻醉，鼻腔內(nèi)接種肺炎鏈球菌D39 標(biāo)準(zhǔn)株溶液6×10CFU/mL 0.1 mL/只，連續(xù)3 d。檢測其感染表現(xiàn)，以小鼠體質(zhì)量不增、出現(xiàn)呼吸急促、安靜少動、脫毛等感染表現(xiàn)為肺炎鏈球菌性肺炎模型制備成功。成模后小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、紫草素低、中、高濃度組及頭孢呋辛酯組，另取鼻腔滴加等量生理鹽水小鼠為對照組，每組10 只。紫草素低、中、高濃度組分別灌胃紫草素12.5 mg/kg、25.0 mg/kg、50.0 mg/kg，頭孢呋辛酯組灌胃頭孢呋辛酯50.0 mg/kg，對照組、模型組灌胃等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)7 d。末次給藥12 h后麻醉處死小鼠，采集肺組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3.2 小鼠肺組織W/D 比值測定

取各組大鼠左肺上葉組織稱濕重（wet weight，W），置于70 ℃干燥箱烘干至恒重后稱干重（dry weight，D），并計算左肺組織W/D比值。

1.3.3 小鼠肺組織肺血管通透性檢測

給藥結(jié)束后，每組采用隨機(jī)數(shù)字表法選取4只小鼠，稱重后尾靜脈注射2% 伊文藍(lán)20 mg/kg，30 min 后麻醉處死，打開胸腔暴露心肺，沖洗肺血管，剪除心臟與肺門組織，除去肺周圍水分及血液，取100 mg 左肺組織小塊以體積比7∶3添加丙酮-生理鹽水溶液3 mL，置于37 ℃溫箱24 h，之后離心取上清采用紫外分光光度計檢測620 nm 處吸光度值，計算每克濕肺中伊文藍(lán)含量，以此反映肺血管通透性。

1.3.4 小鼠肺組織病理學(xué)變化觀察

取各組小鼠右肺上葉組織，10%甲醛固定24 h后，75%乙醇浸泡24 h，石蠟包埋，切片（4 μm）后保存?zhèn)溆?，行蘇木素-伊紅（htoxylin eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.3.5 小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)量檢測

制備1∶9肺組織勻漿，離心后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELLSA），嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測各組小鼠肺組織上清液中IL-1β、TNF-α表達(dá)量。

1.3.6 小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 mRNA 水平檢測

采用RNA提取試劑盒提取右肺組織總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度及純度（OD/OD=1.7～2.0），反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎脤崟r熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法對ERK、p38、NLRP3 mRNA 部分片段進(jìn)行擴(kuò)增。ERK、p38、NLRP3 及內(nèi)參GAPDH 引物序列見表1，反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL ，cDNA（50 ng/μL）2.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddHO 6.0 μL。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環(huán)。采用2法定量分析其相對表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.7 小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 蛋白表達(dá)量檢測

采用蛋白抽提試劑盒提取各組小鼠右肺組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?取50 g 蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，添加一抗anti-ERK1/2（稀釋比1∶10 000）、anti-p38（稀釋比1∶5 000）、anti-pp38（稀釋比1∶1 000）、anti-NLRP3（1∶1 000）、anti-GAPDH 抗體（1∶2 500）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜，添加二抗IgG（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜，顯色，曝片，觀察并分析靶蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)變化

對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理改變。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔充滿滲出物，肺泡間隔增厚，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞。紫草素低、中、高濃度組及頭孢呋辛酯組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞融合，滲出物減少，炎性細(xì)胞浸潤減少，紅細(xì)胞數(shù)量減少。見圖1。

2.2 各組小鼠W/D 比值及肺血管通透性水平比較

與對照組比較，模型組小鼠W/D 比值及肺血管通透性顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠W/D 比值及肺血管通透性依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠濕重/干重（W/D）比值及肺血管通透性水平比較/± s

2.3 各組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)量比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)量顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)量依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)量比較/（n=6，± s）

2.4 各組小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 mRNA 水平比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織ERK1、ERK2、p38、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平均顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠肺組織ERK1、ERK2、p38、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肺組織細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38絲裂素活化蛋白激酶（p38）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣蛋白3（NLRP3）mRNA表達(dá)水平比較/（n=6，± s）

2.5 各組小鼠肺組織ERK、p38 及其磷酸化蛋白、NLRP3蛋白表達(dá)量比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織p-ERK/ERK、p-p38/p38、NLRP3 蛋白表達(dá)量均顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠肺組織p-ERK/ERK、p-p38/p38、NLRP3 蛋白表達(dá)量依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見圖2、表5。

圖2 WB檢測小鼠肺組織ERK、p38及其磷酸化蛋白、NLRP3蛋白表達(dá)

表5 各組小鼠肺組織細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38絲裂素活化蛋白激酶（p38）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣蛋白3（NLRP3）蛋白表達(dá)水平比較/（n=6，± s）

3 討論

肺炎鏈球菌性肺炎是臨床常見呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重時可并發(fā)呼吸衰竭、心力衰竭等嚴(yán)重感染性并發(fā)癥，是導(dǎo)致5 歲以下兒童死亡的首要原因。由于耐藥菌株的出現(xiàn)對抗生素治療效果存在極大限制，因此探究治療肺炎鏈球菌性肺炎的新藥及探究其治病機(jī)制具有重要意義。機(jī)體感染肺炎鏈球菌后可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量促炎因子，例如IL-1β、TNF-α 等，肺內(nèi)炎性遞質(zhì)和炎癥因子的釋放和聚集可導(dǎo)致肺損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔充滿滲出物，肺泡間隔增厚，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，且肺組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)量顯著增加，提示肺部出現(xiàn)損傷、炎癥反應(yīng)明顯，肺炎鏈球菌致肺炎小鼠模型制備成功。肺組織血管通透性升高亦是肺器官功能受損的重要特征，而肺部炎癥反應(yīng)可破壞肺組織，增加肺組織通透性。郭曉夏、安友仲研究報道，降低肺微血管內(nèi)皮屏障通透性可減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠肺組織W/D 比值、肺組織血管通透性顯著增加，提示肺炎鏈球菌感染可導(dǎo)致小鼠肺組織損傷，肺血管通透性增加。紫草素是從天然藥物紫草中提取的萘醌類化合物，具有良好的抗炎、抗菌效果。Zhang 等研究報道，紫草素可抑制MAPK-核因子κB 信號通路，減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。Zhao 等研究報道，紫草素可減輕肺炎球菌溶氣素的生物毒性，降低肺炎小鼠的死亡率，減輕肺組織損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素可呈劑量依賴性降低肺組織W/D 比值、肺血管通透性及肺組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)量，且高劑量效果優(yōu)于陽性藥物頭孢呋辛酯，提示紫草素可能對肺炎鏈球菌性肺炎小鼠具有一定治療作用，可減輕肺血管通透性及肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷。

MAPK 可分為ERK、p38、JNK 和ERK5 4 個亞族，在細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，ERK 主要有ERK1、ERK2 兩種，可參與多種炎性蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，是肺組織慢性炎癥及氣道炎癥反應(yīng)重要調(diào)控因子。NLRP3炎癥小體復(fù)合體由NLRP3、接頭蛋白（ASC）及半胱天冬酶-1（caspase-1）前體組成，NLRP3 激活會誘導(dǎo)促炎蛋白酶caspase-1激活，繼而剪切IL-1β、TNF-α、IL-18等炎性因子并促進(jìn)其激活釋放至胞外，調(diào)節(jié)機(jī)體多種疾病中免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。 IL-1β、TNF-α 等多種因子刺激后可使p38 發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)p38 通路激活，發(fā)揮促炎作用。Zhou 等研究報道，抑制ERK 和p38信號通路可減少膿毒癥大鼠IL-1β、TNF-α 因子釋放，進(jìn)而NLRP3/caspase-1 通路誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。Wang等研究報道，紫草素可通過抑制ERK-核因子κB通路減輕小鼠過敏性氣道重塑。Wang 等研究報道，紫草素可通過抑 制ERK1/2 磷酸化抑制ERK 信號通路抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著增加，提示肺炎鏈球菌感染可促使ERK、p38、NLRP3 信號通路激活。而紫草素可呈劑量依賴性降低ERK、p38、NLRP3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，且高劑量效果優(yōu)于陽性藥物頭孢呋辛酯，提示紫草素減輕肺炎鏈球菌性大鼠肺損傷及炎癥反應(yīng)、降低肺血管通透性，可能與抑制ERK、p38、NLRP3信號通路有關(guān)。

綜上所述，紫草素可降低肺炎鏈球菌性肺炎小鼠肺損傷及炎癥反應(yīng)、降低肺血管通透性，可能與抑制ERK、p38、NLRP3 信號通路有關(guān)。但關(guān)于紫草素的安全劑量及對ERK、p38、NLRP3 信號通路詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。