核因子κB及Nrf2在胎糞吸入急性肺損傷新生大鼠肺組織中的表達(dá)變化

劉文靜，張昕，陳彤，崔秀杰，王愛紅，王鑫，王東關(guān)，于麗

胎糞吸入綜合征（meconium aspiration syn?drome，MAS）是新生兒肺損傷最嚴(yán)重的形式之一，起病原因是缺氧時(shí)胎兒產(chǎn)生呼吸運(yùn)動(dòng)將胎糞吸入氣管內(nèi)或肺內(nèi)，臨床特點(diǎn)是生后出現(xiàn)呼吸窘迫，可并發(fā)肺動(dòng)脈高壓和氣漏，它能促進(jìn)肺組織炎癥的發(fā)生、氣道阻塞、肺表面活性物質(zhì)產(chǎn)生減少。細(xì)胞核因子κB（Nf-κB）信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞因子產(chǎn)生、黏附分子調(diào)節(jié)和急性期蛋白合成的決定性機(jī)制。許多內(nèi)源性和外源性刺激可誘導(dǎo)Nf-κB 的產(chǎn)生。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制Nf-κB 的活化可減輕急性肺損傷（acute lung jnjury，ALI）中肺組織的損傷和炎癥反應(yīng)。Nf-κB可作為一個(gè)控制如敗血癥、哮喘及急性肺損傷等炎癥性疾病的有效藥物靶點(diǎn)。Nrf2 是氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，在細(xì)胞防御中Nrf2 處于核心地位。當(dāng)Nrf2 發(fā)生缺失或激活障礙時(shí)，會(huì)使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，易發(fā)生炎癥修復(fù)延緩、細(xì)胞凋亡、甚至癌癥。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)磺胺多辛通過上調(diào)Nrf2 表達(dá)對(duì)家兔ARDS 具有顯著的抗炎作用。有研究證實(shí)雙氫青蒿素通過激活Nrf2 抑制Nf-κB 信號(hào)途徑，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用；實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nrf2 負(fù)性調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)激活。已有研究證實(shí)Nrf2信號(hào)通路的激活可抑制Nf-κB 的激活和炎癥反應(yīng)。但尚未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nf-κB 在胎糞誘導(dǎo)肺損傷中發(fā)揮作用是否依賴信號(hào)分子Nrf2的激活。本研究自2020 年1―6 月應(yīng)用胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠肺損傷模型，闡述Nf-κB 及Nrf2 在新生大鼠肺損傷模型中的作用機(jī)制及其與肺損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

大鼠30 只，鼠齡范圍為2～3 周，體質(zhì)量范圍為79～100 g，由濟(jì)南市朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［批號(hào)SCXK（魯）20190003］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過了東營市人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批［編號(hào)（2018）倫研批（89）號(hào)］。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，分別為胎糞組、生理鹽水+胎糞組、生理鹽水組，三組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買后在實(shí)驗(yàn)室適宜環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫控制在（22±2）℃，自由光照，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 胎糞混懸液的配置

收集東營市人民醫(yī)院產(chǎn)科經(jīng)病兒近親屬同意后足月健康新生兒第一次胎糞，真空冷凍干燥，研磨成細(xì)粉。在實(shí)驗(yàn)之前，用生理鹽水稀釋成60 mg/mL 的胎糞混懸液，分裝后，于-20 ℃冰箱保存，胎糞培養(yǎng)為無菌狀態(tài)。

1.3 干預(yù)措施

采用Zagariya 等的方法，胎糞組大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥鈉40 mg/ kg，麻醉后置于動(dòng)物解剖臺(tái)上，仰臥位固定，完善氣管插管，導(dǎo)管內(nèi)注入1 mL/kg 的胎糞混懸液，胎糞注入后給予氣管導(dǎo)管內(nèi)推注約2～3 mL空氣確保胎糞注入氣管內(nèi)，拔出氣管導(dǎo)管。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒后給予吸氧處理，并自由進(jìn)食及飲水。生理鹽水組給予新生大鼠氣管插管內(nèi)注入1 mL/kg 的無菌生理鹽水，其它操作步驟同胎糞組；生理鹽水+胎糞組給予新生大鼠氣管導(dǎo)管內(nèi)注入0.5 mL/kg 生理鹽水+0.5 mL/kg 胎糞，并觀察8 h，觀察過程中胎糞組死亡1 只，再次造模，保證每組成功造模數(shù)均為10只。

1.4 標(biāo)本的采集與處理

各組大鼠觀察8 h，麻醉后依次心臟放血處死，取肺組織，生理鹽水沖洗干凈后，10% 左多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲醛透明，石蠟包埋，于切片機(jī)上連續(xù)性切片，厚度4 μm，每隔10片取1片，各標(biāo)本取10片，貼片后標(biāo)記以做備用。

1.5 免疫組化

Nf-κB 抗體（編號(hào)KF742）、Nrf2 抗體（編號(hào)KF324）、免疫組化試劑盒均由上海建成工程有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用試劑、解剖臺(tái)、留置針及實(shí)驗(yàn)耗材等均由濰坊醫(yī)學(xué)院泰山學(xué)者實(shí)驗(yàn)室提供。將石蠟切片于40 ℃恒溫烤箱中放置30 min，依次脫蠟、水化，抗原修復(fù)、雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加用一抗后孵育過夜，DBA 染色后脫水、透明并封片。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測

準(zhǔn)確稱取肺組織在2 500 r/min 離心機(jī)上離心10 min 取上清液，用生理鹽水稀釋10倍作為樣本；取上述樣本應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，應(yīng)用ELI?SA測定三組組織中Nf-κB、Nrf2的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

光學(xué)顯微鏡下觀察組織陽性表達(dá)的細(xì)胞，陽性產(chǎn)物分布于細(xì)胞核內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20 統(tǒng)計(jì)軟件分析，

q

檢驗(yàn)，三組肺組織切片的Nf-κB、Nrf2 陽性表達(dá)情況比較用

χ

檢驗(yàn)，

P

<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變

肉眼觀胎糞組可見肺組織外觀較飽滿，部分肺組織可見斑塊狀、點(diǎn)狀出血灶，生理鹽水+胎糞組可見肺組織外觀略水腫，無明顯肺出血表現(xiàn)；胎糞組HE 染色可見脫落的上皮細(xì)胞、胎糞樣顆粒物，肺泡大小不一、肺泡壁及肺泡腔內(nèi)可見出血，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；生理鹽水+胎糞組可見散在炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡壁及肺泡腔少許出血，見少量脫落上皮細(xì)胞；生理鹽水組肺泡組織大小一致，少許炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 三組肺組織中Nf-κB、Nrf2 免疫組化表達(dá)情況

胎糞組肺組織中Nf-κB 表達(dá)水平比胎糞+生理鹽水組高，胎糞+生理鹽水組中表達(dá)水平比生理鹽水組高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）；胎糞組肺組織中Nrf2 表達(dá)水平高于胎糞+生理鹽水組，在胎糞+生理鹽水組中的表達(dá)明顯高于生理鹽水組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。見表1，圖2。

表1 三組大鼠肺組織中細(xì)胞核因子κB（Nf-κB）、Nrf2表達(dá)變化/x ± s

2.3 ELISA 檢測三組大鼠組織中Nf-κB、Nrf2 表達(dá)情況

胎糞組Nf-κB 表達(dá)水平高于胎糞+生理鹽水組（

P

<0.05）、胎糞+生理鹽水組顯著高于生理鹽水組（

P

<0.01）；胎糞組Nrf2 表達(dá)水平顯著高于胎糞+生理鹽水組（

P

<0.01）、胎糞+生理鹽水組表達(dá)顯著高于鹽水組（

P

<0.01）。見表2。

表2 ELISA檢測顯示不同組別肺組織中細(xì)胞核因子κB（Nf-κB）、Nrf2表達(dá)情況/x ± s

3 討論

胎糞樣羊水在足月或過期產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)，1%～3% 受影響嬰兒可發(fā)展為胎糞吸入綜合征。胎糞吸入綜合征是增加新生兒死亡率的重要原因，具有較高的發(fā)病率，出現(xiàn)呼吸窘迫、頑固性低氧血癥、肺順應(yīng)性下降及肺泡彌漫性滲出等表現(xiàn)，導(dǎo)致肺換氣功能障礙的重癥胎糞吸入綜合征可誘發(fā)急性肺損傷，出現(xiàn)類ARDS 的病理過程。胎糞吸入主要是由胎兒窘迫或胎兒宮內(nèi)吸入引起的，它能促使炎癥、氣道阻塞、肺發(fā)育中斷和肺表面活性物質(zhì)的缺乏。這種疾病的特點(diǎn)是呼吸窘迫及持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓所致的氣道阻塞和肺炎。

MAS 的形成機(jī)制尚不完全清楚。體外研究表明，由于炎癥反應(yīng)在肺泡中積聚的中性粒細(xì)胞和血漿蛋白是表面活性劑的潛在抑制劑，這也能夠解釋胎糞可以使表面活性物質(zhì)失活的原因。有研究表明，胎糞可以刺激IL-8 的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞的氧化爆發(fā)和吞噬作用，在胎糞樣羊水中也可檢測到高水平的IL-6。胎糞吸入也可能致上皮細(xì)胞凋亡。所有這些炎癥反應(yīng)是組成MAS 病理基礎(chǔ)的一部分，胎糞吸入不僅引起新生兒的肺組織結(jié)構(gòu)改變，如上呼吸道完全阻塞、肺不張、肺間質(zhì)肺氣腫或化學(xué)性肺炎，也繼發(fā)一些生理性變化，如低氧血癥、高碳酸血癥、酸中毒、持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓，甚至死亡。本研究HE 染色明確展示了大量中性粒細(xì)胞和脫落的上皮細(xì)胞在肺組織中積聚，并且部分胎糞組肺組織表面可見出血灶，這與上述結(jié)論一致。

本研究探討了胎糞吸入致肺損傷中Nrf2 及NfκB的表達(dá)情況。隨著胎糞吸入濃度的增加，信號(hào)通路Nf-κB 被激活，Nrf2 信號(hào)通路的表達(dá)也增強(qiáng)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推論，胎糞吸入模型涉及氧化應(yīng)激及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的各個(gè)方面。之前的研究表明，抑制炎性細(xì)胞因子的釋放可以治療ALI，通過抑制NF-κB 激活可減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI。這與LPS 誘發(fā)的ALI 不同，主要涉及肺組織的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Nrf2信號(hào)的激活也可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及抗炎基因的表達(dá)。之前的實(shí)驗(yàn)報(bào)道了青蒿琥酯可抑制多聚糖誘導(dǎo)的肺組織TLR4表達(dá)和Nf-κB 的激活，并在體內(nèi)上調(diào)肺組織中Nrf2 和HO-1 的表達(dá)。在我們的研究中，隨著胎糞吸入濃度的增加，2 種信號(hào)因子表達(dá)均有不同程度增強(qiáng)，考慮在胎糞吸入模型中涉及的免疫生理機(jī)制較復(fù)雜，且存在相互作用。因此在我們的胎糞誘導(dǎo)肺損傷模型中Nf-κB 的表達(dá)并不全依賴Nrf2 信號(hào)通路激活后對(duì)其的抑制作用。這與我們之前的推理不符。Nf-κB 是一種普遍存在的快速反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞中，參與許炎癥基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多種內(nèi)源性和外源性刺激均可誘導(dǎo)Nf-κB 活化。在糖皮質(zhì)激素（GCS）基因組調(diào)控機(jī)制中，GCS 與糖皮質(zhì)激素受體（GR）相互作用，復(fù)合物激活后進(jìn)入細(xì)胞核并與DNA 的特定核序列結(jié)合。當(dāng)與反式作用元件作用時(shí)能抑制Nf-κB 和蛋白激活劑（AP）-1 轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制炎性因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等）、酶（PLA-2、COX-2、iNOS等）和其他生物活性物質(zhì)（如PAF、ET-1 等）的表達(dá)。Nf-κB 已被證明在編碼轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子、細(xì)胞因子和生長因子的許多刺激基因的誘導(dǎo)表達(dá)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些物質(zhì)在MAS 的發(fā)病機(jī)制中均起重要作用。因此，胎糞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Nf-κB 活化可能是導(dǎo)致MAS 反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制。本研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組、胎糞+生理鹽水組比較胎糞組肺組織Nf-κB 含量升高，并且有更多的中性粒細(xì)胞浸潤。說明胎糞有明顯中性粒細(xì)胞趨化作用，我們有理由推測隨著胎糞溶液的濃度增高，對(duì)肺組織炎癥刺激更加明顯，導(dǎo)致更多的Nf-κB 活化，而產(chǎn)生不同程度的肺損傷，包括炎癥細(xì)胞浸潤、肺組織間質(zhì)增生、肺氣腫等不良影響。

Nrf2是抗氧化基因激活的關(guān)鍵調(diào)控因子。病理?xiàng)l件下產(chǎn)生的活性氧（ROS）與蛋白質(zhì)相互作用，通過多種途徑損傷機(jī)體。目前，對(duì)Nrf2 的研究表明它是一個(gè)很有前景的ADRS 治療靶點(diǎn)，許多研究表明Nrf2 活化在保護(hù)ALI/ARDS 中的重要性。Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)參與抗氧化損傷保護(hù)的基因表達(dá)。Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白（Keap）1 通過阻止Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合而抑制Nrf2 的活性。Nrf2不僅僅具有細(xì)胞保護(hù)功能；它還調(diào)節(jié)與脂質(zhì)、氨基酸、碳水化合物和核苷酸代謝相關(guān)的基因。最近的一項(xiàng)研究也強(qiáng)調(diào)了Nrf2 的致癌作用；持續(xù)的高核Nrf2 水平被證明可以增強(qiáng)合成代謝途徑中基因的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 抑制導(dǎo)致高氧誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的Nqo1（Nrf2 靶基因）表達(dá)水平降低。Nrf2 缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，過表達(dá)可使細(xì)胞免受促凋亡及高氧應(yīng)激的刺激，通過實(shí)驗(yàn)推測出PI3K/AKT 調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡和隨后的炎癥途徑通過Nrf2-ARE介導(dǎo)的抗氧化轉(zhuǎn)錄反應(yīng)發(fā)揮作用。

MAS 的治療要根據(jù)不同病情采取不同治療策略，包括常規(guī)機(jī)械通氣、高頻通氣、比例輔助通氣、一氧化氮吸入、表面活性物質(zhì)和體外膜肺治療等。Kopincova 等在Nf-κB 選擇性抑制劑IKKNBD 聯(lián)合表面活性物質(zhì)治療胎糞誘導(dǎo)的急性肺損傷的研究中發(fā)現(xiàn)在所有的呼吸參數(shù)檢測中都可見聯(lián)合治療后的快速效果和持續(xù)性效應(yīng)。Li 等研究表明一種類黃酮藥物可通過抑制體內(nèi)外Nf-κB 的核移位，進(jìn)而抑制TNF-α、IL-1β 等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)胎糞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有改善作用。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥、肺水腫、MCP-1 和E-選擇素的表達(dá)具有明顯抑制作用，很可能是由于Nf-κB 信號(hào)通路的失活介導(dǎo)反應(yīng)，表明大黃素對(duì)ALI 有治療效果。高潮氣量下的常規(guī)機(jī)械通氣會(huì)導(dǎo)致肺泡過度擴(kuò)張，導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（Ventilator indused lung injury，VILI）、肺血管通透性增加和促炎遞質(zhì)釋放。有研究證實(shí)Nrf2 在預(yù)防與VILI 相關(guān)的生物刺激反應(yīng)方面的治療作用。Nrf2通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)械通氣誘導(dǎo)的急性損傷反應(yīng)提供保護(hù)。在ALI的模型中Nrf2的激活被證明對(duì)肺損傷有保護(hù)作用。在肺部，包括環(huán)境氧化劑、藥物和病原體在內(nèi)的各種刺激物都能激活Nrf2。Nrf2抗氧化途徑已被證明在各種肺損傷預(yù)防中起重要作用，包括支氣管肺發(fā)育不良、慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、哮喘和過敏等疾病，并被廣泛用作新的治療靶點(diǎn)。本研究旨在通過復(fù)制胎糞誘導(dǎo)ALI 模型，探討Nf-κB、Nrf2 對(duì)胎糞誘導(dǎo)ALI 的作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。如選擇能夠使肺泡隔增厚減輕，并且減少炎性細(xì)胞的浸潤的作用，通過負(fù)調(diào)控Nf-κB 的活性可保護(hù)肺組織并減少炎性因子的刺激的針對(duì)ALI 治療性用藥，對(duì)改善MAS 的預(yù)后有促進(jìn)作用；Nrf2 通路的激活對(duì)胎糞誘導(dǎo)的ALI保護(hù)作用可為之后治療性藥物作用的潛在靶點(diǎn)。我們通過本研究可早期明確Nf-κB、Nrf2在胎糞誘導(dǎo)肺損傷中的作用機(jī)制，對(duì)減輕胎糞誘導(dǎo)肺損傷、預(yù)防新生兒持續(xù)肺動(dòng)脈高壓具有重要意義。