長鏈非編碼RNA PCGEM1及信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3在卵巢癌中的表達(dá)及意義

楊長香，韓自旺，史天云

卵巢癌是女性生殖器官常見惡性腫瘤之一，好發(fā)于絕經(jīng)期女性，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，且近年來呈逐漸上升趨勢，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌發(fā)病早期無特異性癥狀，70%病人確診時(shí)已為中晚期，導(dǎo)致治療效果及預(yù)后差，至今5 年生存率不超過30%，嚴(yán)重威脅女性生命健康。因此，尋找特異性反應(yīng)卵巢癌早期病理特征的腫瘤標(biāo)志物成為近來臨床研究熱點(diǎn)。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類在多物種中具有高度保守性的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮主要作用。有研究報(bào)道，lncRNA PCGEM1 可通過RA 通路誘導(dǎo)卵巢癌發(fā)生發(fā)展。信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and acti?vator of transcription proteins3，STAT3）具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能，研究顯示，STAT3異常表達(dá)與卵巢癌、乳腺癌等密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ln?cRNA PCGEM1 可通過上調(diào)STAT3 表達(dá)參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病及病情進(jìn)展。然而關(guān)于LncRNA PC?GEM1 和STAT3 在卵巢癌中的關(guān)系及作用鮮有研究。因此本研究擬觀察卵巢癌及正常卵巢組織中LncRNA PCGEM1 和STAT3 表達(dá)水平，并分析二者與病人預(yù)后的關(guān)系，旨在為預(yù)后評估提供輔助依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年3 月至2014 年12 月在南陽市第一人民醫(yī)院行卵巢摘除手術(shù)的卵巢癌病人108例，均經(jīng)術(shù)后病理確診，年齡（55.14±8.53）歲，范圍為35～70 歲。根據(jù)2000 年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟臨床分期（FIGO）分為：Ⅰ+Ⅱ期59 例，Ⅲ+Ⅳ期49例；病理分級：G1+G2級62例，G3級46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59 例；鉑類耐藥41 例，鉑類敏感67 例。另因卵巢囊腫需作手術(shù)切除但已證實(shí)無腫瘤細(xì)胞的正常卵巢組織108 例，年齡（53.69±9.18）歲，范圍為35～69 歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=1.202，

P

=0.230），具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理確診為卵巢癌或良好性卵巢囊腫病人；（2）均行卵巢摘除術(shù)；（3）成年女性；（4）半年內(nèi)未接受放化療或其他抗腫瘤藥物治療；（5）病人及其近親屬均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他婦科疾病或惡性腫瘤者；（2）心、肝等功能異常者；（3）月經(jīng)期婦女；（4）資料缺失。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

術(shù)中收集的卵巢癌及正常卵巢組織標(biāo)本，分兩份，一份離體后置于液氮中保存，用于檢測lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達(dá)水平；另一份制成石蠟標(biāo)本，用于檢測STAT3蛋白表達(dá)。

1.3.2 檢測lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測卵巢癌及正常卵巢組織中l(wèi)n?cRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 相對表達(dá)量，儀器購自美國Bio-Rad 公司。采用RNA 提取試劑盒（編號R0011，上海碧云天有限公司）提取組織總RNA，其濃度及純度合格后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，檢測濃度及純度的儀器為紫外分光光度計(jì)，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR 反應(yīng)采用20 μL 體系：TB Green Pre?mix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2× ）（ 編 號RR820A，TaKaRa 生物公司）10 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL ，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（由上海生工合成）（10 μmol/L）各0.8 μL，ddHO 6.0 μL。 反應(yīng) 條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s；60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 及內(nèi)參β-actin 的引物序列見表1。利用公式2計(jì)算lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.3 檢測STAT3 蛋白表達(dá)水平

石蠟組織連續(xù)切片，厚約4 μm，接下來進(jìn)行烘烤、脫水、蘇木素復(fù)染等處理。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富醫(yī)師共同對染色結(jié)果進(jìn)行半定量評分，方法為雙盲法。STAT3 蛋白陽性主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)，主要呈黃色或棕色顆粒。采用免疫反應(yīng)積分（IRS）法評估染色情況：（1）染色強(qiáng)度（SI）積分，無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3 分；（2）陽性染色細(xì)胞百分比（PP）積分，陰性為0 分，PP 1%～10% 為1 分，PP 11%～50% 為2分，PP 51%～75% 為3 分，PP 76%～100% 為4 分。IRS = SI×PP，IRS>3為陽性。

1.4 隨訪

對出院后的卵巢癌病人進(jìn)行為期1～60個(gè)月的隨訪，隨訪方式為打電話或門診復(fù)查，隨訪頻率為每月1 次，以病人死亡或隨訪至2019 年3 月31 日終止，記錄病人隨訪期間生存情況，便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌及正常卵巢組織中l(wèi)ncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達(dá)水平比較

卵巢癌組織中l(wèi)n?cRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于正常卵巢組織（

P

<0.05）。見表2。

表2 卵巢癌及正常卵巢組織中長鏈非編碼RNA PCGEM1（lncRNA PCGEM1）與信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）mRNA表達(dá)水平比較/± s

2.2 STAT3 蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中陽性表達(dá)水平比較

STAT3 蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，呈棕黃色顆粒。與正常卵巢組織比較，卵巢癌組織中STAT3 蛋白陽性表達(dá)率顯著升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。見表3，圖1。

表3 正常卵巢及卵巢癌組織中信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）蛋白陽性表達(dá)率比較/例（%）

2.3 lncRNA PCGEM1 及STAT3 蛋白表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

STAT3蛋白陽性表達(dá)組76 例和陰性表達(dá)組32 例，以lncRNA PCGEM1 表達(dá)水平平均數(shù)（2.41）為界，分為lncRNA PCGEM1 高表達(dá)組（≥2.41）62 例和低表達(dá)組（<2.41）46 例。ln?cRNA PCGEM1 及STAT3 蛋白表達(dá)水平與卵巢癌病人的年齡無關(guān)（

P

>0.05），與FIGO分期、病理分級、是否鉑類耐藥、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（

P

<0.05）。見表4。

表4 長鏈非編碼RNA PCGEM1（lncRNA PCGEM1）及信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）蛋白表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例（%）

2.4 lncRNA PCGEM1及STAT3 mRNA 水平相關(guān)性分析

Pearson 法分析結(jié)果顯示，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PCGEM1 及STAT3 mRNA 水平呈正相關(guān)（

r

=0.575，

P

<0.05）。見圖2。

圖2 卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PCGEM1及STAT3 mRNA水平相關(guān)性分析

2.5 生存曲線分析

隨訪5 年，108 例卵巢癌病人總生存率為29.63%（32/108）。lncRNA PCGEM1 高表達(dá)組5 年生存率為8.33%，顯著低于低表達(dá)組54.35%（χ=39.51，

P

<0.001），STAT3 蛋白陽性表達(dá)組5 年生存率為13.16%，顯著低于陰性表達(dá)組68.75%（χ=26.16，

P

<0.001）。

2.6 COX 分析影響卵巢癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素

COX 多因素分析顯示，順鉑耐藥、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ln?cRNA PCGEM1高表達(dá)、STAT3蛋白陽性表達(dá)是影響卵巢癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

HR

=3.569，95%

CI

為2.114～6.025；

HR

=3.563，95%

CI

為1.827～6.949；

HR

=2.786，95%

CI

為1.495～5.192；

HR

=1.897，95%

CI

為1.161～3.096，均

P

<0.05），見表5。

表5 影響卵巢癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

3 討論

LncRNA 參與多種生物過程，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等過程的作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。隨著芯片技術(shù)和高通量測序方法的進(jìn)步，越來越多LncRNA 被發(fā)現(xiàn)，約1 749 種與卵巢癌有關(guān)。Chen 等研究發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌組織中LncRNA PCGEM1 表達(dá)水平較正常卵巢上皮組織高。Li 等研究證實(shí)，與正常子宮內(nèi)膜組織比較，LncRNA PCGEM1 在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)，且lncRNA PCGEM1 可上調(diào)STAT3 的表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。而STAT3 是一類以二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核與靶DNA 序列結(jié)合、相對分子質(zhì)量為92 kDa 的轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于細(xì)胞質(zhì)，可被多種細(xì)胞因子或其他胞外信號激活發(fā)揮生物學(xué)作用。正常生理狀態(tài)下，STAT3 蛋白的激活短暫而迅速，而STAT3 過度表達(dá)、持續(xù)激活與卵巢癌等多種惡性腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖凋亡有關(guān)。王慶濤等研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中STAT3 陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織。雷波等研究發(fā)現(xiàn)，Th22 細(xì)胞通過釋放IL-22 活化STAT3 通路，使卵巢癌組織中STAT3 磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，以促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表 達(dá) 水 平 及STAT3 蛋白陽性表達(dá)率顯著高于正常卵巢組織，且二者呈正相關(guān)，提示lncRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3 蛋白陽性表達(dá)可能共同作用，與卵巢癌發(fā)生有關(guān)。

Chen 等研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCGEM1 表達(dá)水平與卵巢癌病理分級有關(guān)。王慶濤等研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 蛋白陽性表達(dá)與乳腺癌FIGO 分期、TNM 分期有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3 蛋白陽性表達(dá)與病人FIGO分期、病理分級、鉑類耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3 蛋白陽性表達(dá)可能與卵巢癌的病情進(jìn)展有關(guān)。李碩果等研究顯示，STAT3在食管癌中高表達(dá)且可能與食管癌病人預(yù)后差有關(guān)。王慶濤等發(fā)現(xiàn)，STAT3 高表達(dá)乳腺癌病人生存期短，預(yù)后差。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，ln?cRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3 蛋白陽性表達(dá)病人5年生存率顯著低于lncRNA PCGEM1 低表達(dá)、STAT3蛋白陰性表達(dá)病人，提示lncRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3 蛋白陽性表達(dá)可能影響卵巢癌病人生存期。進(jìn)一步COX 多因素分析結(jié)果顯示，除順鉑耐藥和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因素外，lncRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3蛋白陽性表達(dá)是影響卵巢癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，再次表明lncRNA PCGEM1 高表達(dá)、STAT3 蛋白陽性表達(dá)與卵巢癌病人預(yù)后差密切相關(guān)，有潛力成為監(jiān)測卵巢癌病情進(jìn)展及預(yù)后評估的標(biāo)志分子。

綜上所述，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 及蛋白高表達(dá)，二者高表達(dá)與病人FI?GO 分期、病理分級等臨床病理參數(shù)及5年生存情況有關(guān)，檢測二者表達(dá)有利于早期評估病人預(yù)后。但關(guān)于lncRNA PCGEM1、STAT3 與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制及二者具體調(diào)控關(guān)系尚有待進(jìn)一步加大樣本量、深入研究。