病毒性腦炎病兒腦脊液中微小RNA-21表達(dá)水平與輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的相關(guān)性分析

葛莉，朱麗

病毒性腦炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，以顱壓增高、發(fā)熱、精神及意識(shí)障礙等臨床癥狀為突出表現(xiàn)，以腦實(shí)質(zhì)為主要病理改變，在兒童及成人中均可發(fā)病，但多見于兒童群體。病毒性腦炎的發(fā)病與病毒感染有關(guān)，其中，可引起本病的病毒高達(dá)一百多種。而流行病學(xué)顯示，病毒性腦炎表現(xiàn)出流行性、散發(fā)性特點(diǎn)，發(fā)病率可達(dá)7/10 萬，若救治不及時(shí)，輕者遺留后遺癥，重者可導(dǎo)致患者死亡，這給其家庭帶來了巨大的心理負(fù)擔(dān)。因此，探求病毒性腦炎可能的發(fā)病機(jī)制、干預(yù)靶點(diǎn)一直是研究者們的重要研究?jī)?nèi)容。輔助性T 細(xì)胞17（helper T cell 17，Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是T細(xì)胞中免疫應(yīng)答功能不同的兩種類型，彼此存在拮抗關(guān)系，已有研究表明病毒性腦炎患者體內(nèi)Th17/Treg 處于失衡狀態(tài)。microRNA-21（miR-21）是mi?croRNA 的一種，能通過多種方式影響免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，但這一點(diǎn)在病毒性腦炎中尚未得到證實(shí)。本研究擬通過檢測(cè)病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 表達(dá)水平及Th17、Treg 細(xì)胞比例，分析腦脊液miR-21水平與Th17/Treg平衡的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年9 月至2019 年7 月在撫順市中心醫(yī)院兒科就診的急性期病毒性腦炎病兒（觀察組）108 例作為研究對(duì)象，根據(jù)臨床癥狀、體征和輔助檢查結(jié)果進(jìn)一步分為兩亞組：輕癥組（輕癥病毒性腦炎病兒，57 例）和重癥組（重癥病毒性腦炎病兒，51 例），選取同期撫順市中心醫(yī)院兒科出院前復(fù)查已康復(fù)的病毒性腦炎病兒（對(duì)照組）110 例作為對(duì)照。收集兩亞組、對(duì)照組性別、年齡等一般資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病毒性腦炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)與《傳染病學(xué)（第8 版）》中有關(guān)描述相符，其中，當(dāng)病毒性腦炎病兒符合頻繁抽搐或驚厥持續(xù)、肢體癱瘓癥狀、頭部CT/MR 檢查提示腦干出現(xiàn)異常密集灶或腦實(shí)質(zhì)、意識(shí)障礙中至少兩條描述時(shí)，納入重癥組，否則納入輕癥組。（2）所有受試兒童監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情并簽署紙質(zhì)版知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、生長(zhǎng)發(fā)育異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、先天性心肝腎功能異常及其他顱腦病變病兒。（3）近期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物。（4）不服從檢測(cè)安排者。（5）資料不真實(shí)或不全者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑與儀器

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（型號(hào)：ABI 7500 Sequence De?tection System）購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。人白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）酶聯(lián)免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)EK0410、EK0416、EK0430）購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司；人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）ELISA 試劑盒（貨號(hào)C505058）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)MODEL550）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)FACS CantoⅡ）購(gòu)自美國(guó)BD公司；流式細(xì)胞儀采用的流式抗體均購(gòu)自美國(guó)eBio?science公司。

表1 引物序列表

1.3 腦脊液采集及指標(biāo)檢測(cè)

所有受試者均行無菌腰椎穿刺術(shù)，常規(guī)抽取腦脊液分成3份待檢。

一份qRT-PCR法檢測(cè)miR-21相對(duì)表達(dá)量，試劑盒法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6 為內(nèi)參，熒光定量PCR 檢測(cè)miR-21 相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本3 次重復(fù)，2法計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)量。

一份采用ELISA 法檢測(cè)IL-6、IL-10、IL-17、TGFβ 水平，試驗(yàn)方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定吸光度（值，3 次重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD 值計(jì)算IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β水平。

一份流式細(xì)胞儀分析Treg、Th17 細(xì)胞水平，密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mono-nuclear cell，PBMCs），PBS 重懸PBMCs 細(xì)胞，取細(xì)胞懸液20 μL 分成2 份，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度后分別加入流式細(xì)胞儀抗體，其中，Treg管的單克隆抗體采用Foxp3 Alexa Fluor488/CD25 PE/CD4 PerCP，Th17管的單克隆抗體采用IL-17 Alexa Fluor647/CD3 FITC/CD4 PE，試驗(yàn)方法均嚴(yán)格按照流式細(xì)胞檢測(cè)說明書進(jìn)行，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平，結(jié)果用FACS Express 3.0 軟件分析，計(jì)算Treg、Th17和Treg/Th17。

2 結(jié)果

2.1 病兒一般資料比較

對(duì)照組與觀察組，輕癥組與重癥組受試兒童性別、年齡均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05），具有可比性。見表2，3。

表2 病毒性腦炎對(duì)照組與觀察組一般資料比較

表3 病毒性腦炎輕癥組與重癥組一般資料比較

2.2 兩組腦脊液中miR-21、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較

與對(duì)照組比較，觀察組腦脊液中miR-21、Th17、Th17/Treg 水平明顯升高（

P

<0.05），Treg 水平明顯降低（

P

<0.05）。見表4。

表4 病毒性腦炎對(duì)照組與觀察組腦脊液中微小RNA-21（miR-21）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、Th17/Treg水平比較/± s

2.3 兩組腦脊液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平比較

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組病毒性腦炎病兒腦脊液中IL-6、IL-17 水平明顯升高（

P

<0.05），IL-10、TGF- β水平明顯降低（

P

<0.05）。見表5。

表5 病毒性腦炎對(duì)照組與觀察組腦脊液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）水平比較/（ng/L，± s）

2.4 不同嚴(yán)重水平病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21、Th17、Treg、Th17/Treg 水平比較

與輕癥組相比，重癥組病兒腦脊液中miR-21、Th17、Th17/Treg水平明顯升高（

P

<0.05），Treg 水平明顯降低（

P

<0.05）。見表6。

表6 病毒性腦炎輕癥組與重癥組腦脊液中微小RNA-21（miR-21）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、Th17/Treg水平比較/± s

2.5 不同嚴(yán)重水平病毒性腦炎病兒腦脊液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平比較

與輕癥組相比，重癥組腦脊液中IL-6、IL-17 水平明顯升高（

P

<0.05），IL-10、TGF-β水平明顯降低（

P

<0.05）。見表7。

表7 病毒性腦炎輕癥組與重癥組腦脊液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）水平比較/（ng/L，± s）

2.6 病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21、Th17/Treg水平與IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 水平、Th17/Treg 水平與IL-6、IL-17 水平均明顯正相關(guān)（

P

<0.05），與IL-10、TGF-β 水平均明顯負(fù)相關(guān)（

P

<0.05）。見表8。

表8 病毒性腦炎病兒腦脊液中微小RNA-21（miR-21）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）水平的相關(guān)性分析

2.7 病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 水平與Th17/Treg 的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 水平與Th17/Treg 明顯正相關(guān)（

r

=0.553，

P

<0.05）。見圖1。

圖1 病毒性腦炎病兒腦脊液中微小RNA-21（miR-21）與輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的相關(guān)性分析

3 討論

病毒性腦炎是兒科常見疾病，當(dāng)病兒機(jī)體抵抗力低時(shí)，病毒可侵犯人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)中樞神經(jīng)組織細(xì)胞造成損害。其中，病毒對(duì)機(jī)體的損害機(jī)制可具體分為直接損害和間接損害，直接損害為病毒及其釋放的毒素對(duì)腦組織、腦細(xì)胞造成的損傷，間接損害為病毒及其釋放的毒素激活顱內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)后，產(chǎn)生的大量炎性因子對(duì)局部腦組織、腦細(xì)胞造成的損害。有研究表明，與直接損害相較，間接損害對(duì)治療后不良事件發(fā)生的影響更為嚴(yán)重。T細(xì)胞是人體主要的免疫細(xì)胞，參與病毒感染機(jī)體后的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而CD4T 細(xì)胞作為T 細(xì)胞的重要類型，在病毒及其釋放的毒素刺激下可分化為多個(gè)亞群，其中，Th17、Treg 是維持免疫穩(wěn)定、免疫耐受過程的兩個(gè)重要亞群，彼此聯(lián)系緊密，功能相互抑制，當(dāng)機(jī)體運(yùn)行正常時(shí)保持動(dòng)態(tài)平衡，共同維持機(jī)體的免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，當(dāng)免疫應(yīng)答激活后，Th17/Treg 狀態(tài)失衡引起炎癥反應(yīng)，參與疾病發(fā)病后的免疫調(diào)控。

有研究表明，初始T 細(xì)胞分化發(fā)育方向受制于所處周圍環(huán)境，當(dāng)機(jī)體周圍環(huán)境中IL-1β、IL-6 和TGF-β 濃度處于高水平時(shí)，初始T 細(xì)胞分化發(fā)育方向趨向于Th17 細(xì)胞，由Th17 細(xì)胞調(diào)控分泌的IL17、IL-6、IL-23 等細(xì)胞因子隨之增加；當(dāng)周圍環(huán)境中只有TGF-β 處于高水平時(shí)，初始T 細(xì)胞分化發(fā)育方向趨向于Treg 細(xì)胞，由Treg 細(xì)胞調(diào)控分泌等IL-4、IL-10、TGF-β 細(xì)胞因子隨之增加。本研究中，隨著病毒性腦炎的發(fā)生與病情的加重，患者腦脊液中Treg、IL-10、TGF-β 水平明顯降低，Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17 水平明顯升高，且Th17/Treg 與IL-10、TGF-β 水平明顯負(fù)相關(guān)，與IL-6、IL-17 水平明顯正相關(guān)，這表明病毒性腦炎患者體內(nèi)存在免疫調(diào)控，Treg、Th17、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 均參與其中。Zhang 等研究表明，IL-6 是決定Th17、Treg 分化相對(duì)比例的重要細(xì)胞因子，本研究結(jié)果與之一致。且IL-6 水平升高導(dǎo)致初始T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化后，進(jìn)一步導(dǎo)致由Th17 分泌的IL17、IL-6 水平升高，由Treg 分泌的IL-10、TGF-β 水平水平降低，如此循環(huán)往復(fù)，Th17/Treg呈現(xiàn)出失衡狀態(tài)。

miR-21 是非編碼小片段RNA 分子miRNA 中的一員，與自身免疫性疾病、癌癥、腎臟疾病、心血管疾病、炎癥相關(guān)性疾病中均密切相關(guān)。謝子英等研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 與急性胰腺炎患者細(xì)胞內(nèi)感染程度、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性，推測(cè)miR-21表達(dá)上調(diào)可影響機(jī)體全身性炎癥反應(yīng)爆發(fā)，導(dǎo)致IL-6、IL-8、TNF-α 等炎性因子的過量釋放。姚紹鑫等研究表明，肝癌大鼠外周血miR-21 水平上調(diào)，與Treg/Th17比值明顯正相關(guān)，但具體分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)制未知。但在于海奕等人的研究中，大鼠心肌細(xì)胞IL-6 水平增加后，可通過增強(qiáng)STST3 活性促進(jìn)miR-21 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，共同參與心室重構(gòu)。本研究中，隨著病毒性腦炎的發(fā)生與病情的加重，患者腦脊液中miR-21 水平明顯升高，與IL-10、TGF-β 水平明顯負(fù)相關(guān)，與IL-6、IL-17、Treg/Th17水平明顯正相關(guān)，這表明miR-21參與病毒性腦炎的發(fā)生及病情加重過程，與IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、Treg/Th17 均有明顯的相關(guān)關(guān)系。結(jié)合前人研究，本研究結(jié)果表明，病毒性腦炎腦脊液中miR-21 表達(dá)上調(diào)，可能與IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平相互影響，共同參與免疫調(diào)控，即Th17/Treg的失衡過程。

綜上所述，病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21表達(dá)水平、Th17/Treg 均明顯增加，兩者明顯正相關(guān)，miR-21 水平升高可能對(duì)Th17/Treg 失衡有促進(jìn)作用。雖然研究結(jié)果表明，miR-21 對(duì)Th17/Treg 失衡的影響可能有IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 的參與，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。