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    乙肝相關性肝癌組織中細胞凋亡蛋白抑制因子2蛋白的表達變化及其意義

    2021-10-30 05:52:48高鵬劉小磊賈占嶺
    安徽醫(yī)藥 2021年11期

    高鵬,劉小磊,賈占嶺

    乙肝相關性肝癌的發(fā)生率具有顯著的上升,流行病學研究證實,乙肝相關性肝癌的發(fā)生率可達(272~738)/10 萬人。臨床上乙肝病毒感染肝相關性肝癌遠期肝功能惡化的風險較高。

    腫瘤生物學相關分子的表達,能夠通過影響腫瘤細胞的癌細胞特性,從而影響癌細胞的凋亡抑制、分化障礙等過程。凋亡蛋白抑制因子2(inhibi?tor of apoptosis protein,IAP2)能夠通過調控癌細胞的細胞周期,抑制癌細胞的凋亡,進而影響腫瘤的發(fā)生和遠期的腫瘤分期的進展。部分研究揭示了IAP2 在影響肝癌、甲狀腺癌及肺癌等腫瘤發(fā)生過程中的作用,認為IAP2的表達上升是促進腫瘤病人病死率上升、高腫瘤負荷表現(xiàn)的重要因素,但對于IAP2 與肝癌的關系研究不足。為了深入揭示IAP2的表達與肝癌的關系,從而為臨床上乙肝相關肝癌的發(fā)生和治療研究提供理論基礎,本研究選取術后乙肝相關性肝癌組織標本80例,探討了相關指標的改變及其與病人的病理學特征的相關性。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取河南省傳染病醫(yī)院2015 年1月至2017 年6 月乙肝相關性肝細胞癌術后組織標本80 例(A 組)、非乙肝相關性肝細胞癌術后組織標本40 例(B 組)、乙肝相關性肝細胞癌旁組織(C 組)40例。A組男45例,女35例,年齡(56.3±12.0)歲,年齡范圍為39~78 歲,乙肝相關性肝細胞癌病人臨床分期:Ⅰ期12 例,Ⅱ期33 例,Ⅲ期20 例,Ⅳ期15 例;腫瘤病灶的數(shù)目情況:單發(fā)42 例,多發(fā)38 例;其中淋巴結轉移陽性的病人36 例。B 組男24 例,女16 例,年齡(55.7±10.0)歲,年齡范圍為42~79歲,非乙肝相關性肝細胞癌病人臨床分期:Ⅰ期8 例,Ⅱ期16 例,Ⅲ期10 例,Ⅳ期6 例;腫瘤病灶的數(shù)目:單發(fā)20 例,多發(fā)20例;其中淋巴結轉移陽性的病人17例。C 組40 例標本選自A 組80 例病人中符合癌旁組織定義的病人(距離腫瘤病灶邊緣<3.0 cm 的組織),男22例,女18 例,年齡(56.0±10.9)歲,年齡范圍為41~76歲;臨床分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期16例,Ⅲ期14例,Ⅳ期4 例;腫瘤病灶的數(shù)目情況:單發(fā)23 例,多發(fā)17 例;其中淋巴結轉移陽性的病人16 例。三組病人的年齡、性別、腫瘤數(shù)目、臨床分期、淋巴結轉移情況比較,差異無統(tǒng)計學意義(

    P

    >0.05),具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

    納入標準:①肝細胞癌的診斷標準按中華醫(yī)學會制定的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范2014年版》標準;②乙肝相關性肝細胞癌病人:血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)陽性;③未使用放療、化療治療和免疫治療;④納入對象資料完整,病人或其近親屬知情同意。

    排除標準:①未經病理學證實;②轉移性肝癌;③資料缺失,難以進行統(tǒng)計分析。

    1.2 免疫組織化學方法

    石蠟包埋,連續(xù)性切片厚度3 μm,60 ℃烤片120 min,常規(guī)脫水后,采用EDTA進行抗原修復,加入10 μL蒸餾水,加入10% 過氧化氫覆蓋,室溫下孵育30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,每次3 min,加入IAP2蛋白的單克隆抗體(1∶1 000 購自羅氏檢測公司),37 ℃孵育60 min,PBS洗滌3 次,每次3 min,加入HRP 標記的IAP2 蛋白二抗(1∶2 000 購自羅氏公司),37 ℃孵育20 min,PBS 洗滌3 次,每次3 min,加入DAB 后,PBS 沖洗和復染,脫水后在顯微鏡下進行觀察。

    免疫組織化學結果判定:IAP2 蛋白在肝癌細胞的細胞質中為主要分布位置,經免疫組化染色后陽性表達可呈現(xiàn)出黃色、棕黃色、褐色。①依據(jù)IAP2 蛋白顏色深度進行評分:未見明顯的顏色為0分,可見淡黃色染色為1 分,可見棕黃色染色為2分,可見褐色甚至更深的顏色為3 分;②根據(jù)IAP2陽性染色細胞占比情況進行評分:陽性染色細胞占比≤10% 評價為1 分,陽性染色細胞占比11%~50%評價為2分,陽性染色細胞占比51%~75% 評價為3分,陽性染色細胞占比>75% 評價為4 分,細胞占比評分與染色深度評分相乘總分<3分為陰性、≥3分為陽性。

    1.3 蛋白質印跡法(Western blotting)檢驗

    采用新鮮組織,研磨法獲取蛋白,將所研磨的蛋白與上樣緩沖液以5∶1 的濃度相互混合,80~100 ℃煮沸5 min。根據(jù)不同的蛋白分子量水平,配制并灌注相應的12%的分離膠和5%的濃縮膠,每孔按15 g 蛋白量進行組織蛋白的上樣,進行十二磷酸磺酸鈉電泳,電泳后根據(jù)條帶進行切膠,半濕法轉移至硝酸纖維素膜,BSA 蛋白封閉2 h,加入含10%BSA 一抗及二抗(1∶1 000),磷酸鹽緩沖液清洗3 次,每次5 min,進行曝光及膠片灰度值的讀取。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料采用

    x ± s

    表示,三組間比較采用單因素方差分析法,組間兩兩比較采用LSD-

    t

    檢驗;率的比較采用

    χ

    檢驗,

    P

    <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 三組IAP2蛋白陽性表達率比較

    A 組IAP2蛋白陽性表達率為76.25%,高于B 組的35.00% 和C 組的30.00%,差異有統(tǒng)計學意義(

    χ

    =31.063,

    P

    <0.05),見表1。

    表1 肝細胞癌三組凋亡蛋白抑制因子2(IAP2)蛋白陽性表達率比較/例(%)

    2.2 三組IAP2 蛋白積分光密度累積值比較

    A 組IAP2 蛋白積分光密度累積值(16 840.6±2 251.7)高于B 組(13 895.0±1 664.1)和C 組(13 505.2±1 814.3),差異有統(tǒng)計學意義(

    F=

    29.068,

    P

    <0.05)。

    2.3 IAP2 蛋白陽性表達與乙肝相關性肝細胞癌病理學特征的關系

    乙肝相關性肝細胞癌病人Ⅲ~Ⅳ期、包膜侵犯、門脈侵襲、發(fā)生淋巴結轉移病人癌組織中IAP2 蛋白的陽性表達率顯著高于乙肝相關性肝細胞癌病人Ⅰ~Ⅱ期、未發(fā)生包膜侵犯、未發(fā)生門脈侵襲、未發(fā)生淋巴結轉移病人的癌組織(

    P

    <0.05),見表2。

    表2 凋亡蛋白抑制因子2(IAP2)蛋白陽性表達與乙肝相關性肝細胞癌病理學特征的關系/例(%)

    3 討論

    乙肝病毒感染導致的肝臟上皮細胞的持續(xù)性DNA 分裂異常,能夠影響肝癌的發(fā)生,促進肝癌病理過程的進展。作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,肝癌的無瘤生存時間較低,包括手術在內的相關綜合性治療措施治療后的3 年內病死率仍然超過37%?,F(xiàn)階段缺乏對于肝癌早期診斷的有效生物學血清分子,本研究通過探討腫瘤相關蛋白的表達特點,旨在為肝癌發(fā)生機制的研究提供參考,為乙肝病毒感染相關性的肝癌的免疫靶向治療提供研究靶點。

    腫瘤細胞的增殖或凋亡的抑制在平衡上皮細胞的生理功能的過程中發(fā)揮了較為重要的作用。凋亡抑制能夠提高上皮細胞的持續(xù)性增殖的風險。IAP2 蛋白作為凋亡抑制蛋白,其生物學效應在于能夠抑制癌細胞程序性凋亡分子的激活,持續(xù)性地促進上皮的增殖過程。生理情況下IAP2 蛋白的表達濃度較低,而在急性感染或組織損傷及代償性增生的過程中,IAP2 蛋白可呈現(xiàn)出一過性的上升表現(xiàn)。近年來相關研究證實,IAP2 蛋白能夠在影響惡性腫瘤上皮細胞的發(fā)生過程中發(fā)揮較為重要的調控作用,其能夠抑制細胞凋亡的程序性啟動過程。部分研究已經報道了IAP2 蛋白在乙肝病毒相關性肝癌病人病灶組織中的表達差異,認為IAP2蛋白的高表示與肝癌病人的病情相關。

    在乙肝相關性肝細胞癌病人病灶組織中,IAP2蛋白的表達陽性率明顯上升,高于非乙肝肝細胞癌組及正常對照肝臟組織,差異明顯,提示了IAP2 蛋白可能在促進乙肝相關性肝癌的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用,薈萃國內外的相關文獻,主要考慮與下列因素有關:(1)IAP2蛋白能夠導致乙肝病毒的整合作用的增強,其能夠提高乙肝病毒整合宿主細胞的能力,導致宿主細胞肝臟上皮組織的增殖風險明顯的增強;(2)IAP2 蛋白能夠導致肝臟上皮細胞核的異型性,造成上皮細胞生物學活性的改變,增加癌細胞的分化調控障礙的風險。李林豐等研究者認為,在乙肝相關性肝癌病人病灶組織中,IAP2 蛋白的表達陽性率可平均上升27%,同時在病程較長、臨床分期較晚或病死率較高的肝癌病人中,IAP2 蛋白的表達陽性率可進一步地上升。免疫組化具體分析可見,IAP2 蛋白主要定位于癌細胞膜周邊或者細胞質中,特別是在癌細胞異型性較為明顯的區(qū)域,IAP2蛋白的染色強度較深。IAP2蛋白定量水平的研究也證實IAP2 蛋白在乙肝相關性肝癌病人病灶組織中的高表達趨勢,但部分研究者并不認為IAP2 蛋白的表達在乙肝相關性肝癌病人中具有特異性,認為IAP2蛋白在非乙肝病毒肝癌病人體內同樣存在明顯的高表達,并認為乙肝相關或非乙肝相關肝細胞肝癌病人中IAP2 蛋白的表達并無差異。本研究發(fā)現(xiàn)在乙肝相關性肝細胞癌病人中IAP2 蛋白的表達陽性率明顯的上升,存在不同的結論可能與IAP2蛋白的檢測方法、乙肝相關性肝細胞癌的病程階段的不同等因素有關。在分析IAP2 蛋白與肝細胞癌病人病理特征關系的過程中發(fā)現(xiàn),IAP2 蛋白陽性表達與乙肝相關性肝細胞癌病人的臨床分期、包膜侵犯、門脈侵襲、發(fā)生淋巴結轉移具有顯著的相關關系,提示IAP2蛋白能顯著影響肝細胞癌病人病情的進展,這主要由于IAP2蛋白對于癌細胞內凋亡調控蛋白BCL-2 蛋白或者BAX 蛋白的轉錄翻譯影響,能夠誘導癌細胞的浸潤能力、淋巴結黏附能力等的改變,加劇其對于鄰近正常上皮組織的浸潤,能夠導致肝細胞癌病人臨床分期的進展和包膜的浸潤。

    本研究的創(chuàng)新性在于探討了C-IAP2 的表達與肝細胞癌病人病理特征的關系,可以為診斷提供一定診斷方向,但由于本組研究納入的樣本數(shù)量較小,樣本來源地域也較狹窄,在隨后的研究中我們會進一步擴充樣本量,加進后續(xù)分析,以及預后情況分析等。綜上所述,IAP2 蛋白表達在乙肝相關性肝細胞癌組織中表達顯著的提高,并且與病人的臨床分期、包膜侵犯、門脈侵襲、發(fā)生淋巴結轉移具有顯著的相關關系。

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