骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)Nrf2/HO?1信號通路對創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠神經(jīng)的保護作用

孫啟孟，李宗明，張姣

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種包含中樞神經(jīng)組織發(fā)生一系列病理生理機制及分子細胞水平變化的神經(jīng)系統(tǒng)受損，患者死亡率及致殘率較高。伴隨地質(zhì)災(zāi)害、社會交通運輸業(yè)發(fā)展和其他導(dǎo)致脊髓損傷意外發(fā)生率不斷增大，SCI 對患者家庭和社會帶了沉重的醫(yī)療負擔(dān)。我國脊柱損傷發(fā)生率是25～35/10 萬人，約有1/6 人伴隨脊髓受損，且臨床患者多數(shù)是低于40 歲的青壯年?；诟杉毎麣w巢于靶區(qū)、分化潛能及自我更新等獨特特點，干細胞療法已逐漸成為臨床各種疑難雜癥研究熱點，SCI 有效療法之一為骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）移植。BMSCs 可分化、替代受損脊髓組織及分泌細胞因子等遞質(zhì)，對炎癥反應(yīng)抑制和內(nèi)源性修復(fù)機制激活使組織修復(fù)。BMSCs 有分化為多種不同間充質(zhì)譜系的能力的多能祖細胞，對治療SCI 很多病理生理學(xué)癥狀非常合適。SCI 前期階段機體內(nèi)脂肪酸被膜磷脂水解而形成過氧化脂質(zhì)、生物活性細胞酸，進而產(chǎn)生活性氧自由基。同時，高水平活性氧（reactive oxygen species，ROS）可激活白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎癥因子，導(dǎo)致線粒體功能障礙。氧化應(yīng)激反應(yīng)過程涉及了不同連續(xù)程序性和非程序性死亡，進而造成神經(jīng)元凋亡。所以，我們應(yīng)盡力降低受損細胞凋亡。而核因子E2 相關(guān)因子2（NFE2-Related Factor2，Nrf2）抗氧化通路是機體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)主要路徑，受理化因素刺激打破了Nrf2 和Kelch 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）間正常聯(lián)系，Nrf2轉(zhuǎn)位到細胞核，和抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合，細胞保護蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄及解毒酶激活，如血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase1，NQO1］等。因此，本研究2019 年6―11 月分析BMSCs 移植通過Nrf2/HO-1 信號通路對SCI 大鼠神經(jīng)保護影響，為臨床治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選取4 周齡SD 雄性大鼠10 只及8周齡雄性大鼠45只，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號：SCXK（京）2019-21。本研究符合動物實驗倫理要求。

1.2 實驗試劑與儀器

試劑：0.25% 胰酶-EDTA 溶液（美國Sigma 公司），TNF-α 及IL-6 試劑盒（美國Abbkine公司），DMEM 培養(yǎng)基與胎牛血清（美國Gib?co 公司），膠原纖維酸性蛋白（collagen fibrillary acid?ic protein，GFAP）抗體、Nrf2 抗體、神經(jīng)元（neuron，NeuN）抗體、HO-1抗體及NQO1抗體（美國Abcam公司）。儀器：熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），脊髓打擊器（美國PSI 公司），C6 流式細胞儀（美國BD 公司），恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 研究方法

（1）分離、鑒定BMSCs：由10只4周齡的SD大鼠兩側(cè)股骨與脛骨內(nèi)采集BMSCs，而后置入DMEM 培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清，細胞數(shù)1×10/mL），對細胞生長情況采用顯微鏡監(jiān)測，待細胞融合80% 至90% 時，采用含有0.25%EDTA 胰蛋白酶消化，1∶2傳代，在5% 二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)，3～5 d 傳代。表型鑒定：第4 代細胞貼壁滿瓶后消化計數(shù)，細胞密度調(diào)整為1×10/mL，選取100 L 在5 支EP 管內(nèi)并標號，分別加入CD450.5 L+CD440.3 L、CD900.1 L、CD345 L+CD900.1 L、CD440.3 L和不加任何抗體的空白對照。4 ℃下避光孵育30 min，而后置入500 L PBS 溶液，離心5 min 后棄上清液。流式細胞儀鑒定BMSC 表型。多潛能分化能力鑒定：選取第3 代細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，濃度為1×10/L，待細胞貼壁生長至細胞密度80% 時，在誘導(dǎo)孔完全培養(yǎng)液內(nèi)置入成骨細胞誘導(dǎo)劑（50 mmol/L抗壞血酸磷酸鹽+1 mmol/Lβ 磷酸甘油+1 mmol/L 地塞米松）、成脂誘導(dǎo)劑（0.2 mmol/L吲哚美辛+1 mmol/L 地塞米松+50 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+10 mg/L胰島素）。每周換液2次，未加誘導(dǎo)培養(yǎng)液細胞作為對照。成脂細胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)18 d 后，采用40 g/L 多聚甲醛固定，誘導(dǎo)分化脂肪細胞行油紅O 染色；成骨細胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)21 d 后，采用40 g/L 多聚甲醛固定對誘導(dǎo)分化成骨細胞行堿性磷酸酶染色。（2）模型建立和BMSCs 移植：45 只大鼠隨機數(shù)字表法分為三組，分別為假手術(shù)組、模型組和實驗組，每組15只。大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，背部正中切口為脊椎T10節(jié)段，軟組織鈍性分離，脊椎椎板及棘突去除，假手術(shù)組縫合切口，剩余兩組使用打擊器對脊髓打擊，力度20 kPa。造模成功標準：打擊后大鼠快速出現(xiàn)搖尾反射，兩后肢和軀體回縮撲動，而后出現(xiàn)遲緩性癱瘓，脊髓表面快速呈現(xiàn)紫色瘀。模型組、實驗組大鼠均成功造模，造模后大鼠均存活，無傷口感染狀況，大鼠雙后肢癱瘓。成功造模后實驗組大鼠將0.5 mL 的BMSCs 細胞懸液（1×10/mL）經(jīng)尾靜脈注射，模型組與假手術(shù)組大鼠注射等劑量PBS溶液。

1.4 觀察指標

（1）行為學(xué)檢測：術(shù)前、術(shù)后1、3、7、14、21 及28 d 采用運動功能評分（the Basso，Beattie，Bresnahan locomotor rating sacle，BBB）評分檢測大鼠運動功能恢復(fù)情況。BBB 評分最低0 分，說明大鼠沒有運動功能，完全癱瘓；最高評分21分，說明大鼠運動功能正常。（2）脊髓損傷7 d 后大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，全身灌注40 g/L 多聚甲醛，選取1 cm 受損脊髓，石蠟包埋，制備為5 m 石蠟切片，行HE 染色。（3）免疫熒光染色追蹤移植細胞：為評估BMSCs分化狀況，大鼠移植后第4周，心臟灌注獲取受損脊髓組織。為鑒別移植細胞類型，采用針對GFAP（1∶50）、少突膠質(zhì)細胞（CC-1，1∶50）及NeuN（1∶100）細胞標志物對分化移植細胞定位。經(jīng)過表達細胞標志物GFAP、CC-1、NeuN和PKH26、DAPI共定位細胞認為是陽性細胞。每張載玻片選取6 個視野，記錄大鼠獨立區(qū)域內(nèi)陽性細胞的平均數(shù)值。（4）ELSIA 檢測IL-6、TNF-α 蛋白含量：脊髓受損7 d 后選取大鼠受損脊髓組織，脊膜剝除，依據(jù)1∶1加冰生理鹽水在4 ℃下勻漿，離心后取上清液，依據(jù)試劑盒說明書進行。（5）Western blotting 檢測脊髓受損7 d后組織內(nèi)Nrf2/HO-1 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白及GFAP、NeuN 蛋白表達：常規(guī)提取細胞總蛋白，上樣電泳，80 V 電壓，溴酚藍染料至分離膠提高電壓為100 V，分離膠下泳出溴酚藍結(jié)束電泳。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜內(nèi)進行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，30 mA 恒流，持續(xù)80 min。5%TBST 脫脂奶粉封閉PVDF 膜，震蕩50 min。封閉結(jié)束后洗膜3 次，每次10 min，膜移至雜交袋，置入漂洗液稀釋抗體，孵育過夜。洗膜3 次，每次10 min，置入過氧化物酶標記二抗，震蕩50 min。ECL 顯色液中將PVDF 膜溫育6 min，依次曝光、顯影、定影，IPP 軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 細胞培養(yǎng)狀況

細胞接種24 h 后可看到小圓形細胞，貼壁細胞逐步增加；在接種5 d 后細胞分散集落，為放射狀朝四周延伸；接種7～10 d 后細胞融合達80%～90%，細胞貼附緊密，為長梭形有序排列，需傳代；細胞傳代消化時間隙變寬，細胞變圓、變短；傳代后細胞迅速貼壁，為扁平型或梭形生長，3 d 后細胞融合達50%，5～7 d 融合80%～90%，經(jīng)3 至4 次傳代后形成典型扁平型或梭形排列緊密BMSCs細胞，見圖1。

2.2 鑒定BMSCs 表型

CD44CD45細胞群占比99.40%，空白對照組細胞群占比97.90%，CD90CD3 4細胞群占比80.70%，CD44細胞群占比99.20%，CD90細胞群占比91.10%，符合BMSCs 表達血細胞表面抗原標志CD44、CD90，但不表達CD45、CD34的特征，見圖2。

圖2 流式細胞儀鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）表面抗原：A為空白對照；B為抗體CD90+；C為抗體CD44+；D為抗體CD90+、CD34－；E為抗體CD44+、CD45－

2.3 各組大鼠病理組織學(xué)檢測情況

假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，形成空泡，大量炎性細胞浸潤；實驗組大鼠依然存在空泡，但組織結(jié)構(gòu)有所改善，炎癥細胞顯著減少，見圖3。

2.4 各組大鼠BBB 評分情況

脊髓受損后7、14、21、28 d 時實驗組大鼠BBB 評分分別為（6.27±1.44）分、（11.15±1.53）分、（14.02±1.50）分、（15.14±1.60）分均高于模型組的（4.73±1.35）分、（8.52±1.49）分、（9.95±1.62）分、（11.67±1.65）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=3.022、4.769、7.140、5.847，

P

=0.005、0.000、0.000、0.000）。

2.5 BMSCs 橫向多潛能分化能力誘導(dǎo)情況

加入成脂誘導(dǎo)劑18 d 后，誘導(dǎo)所形成脂肪細胞累積脂質(zhì)，脂滴變大切合并成串珠狀，經(jīng)染色后為鮮紅色，j見圖4A。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)21 d后，堿性磷酸酶染色可看到細胞膜與胞質(zhì)中顆粒呈陽性反應(yīng)，染色為藍黑色顆粒，塊狀深染顆粒，見圖4B。

2.6 免疫熒光評估受損脊髓組織內(nèi)BMSCs分化狀況

PKH26 與GFAP 蛋白共定位細胞數(shù)最多，為（52.89±10.63）% ，其次是少突膠質(zhì)細胞（CC-1）（44.48±1.36）% ，NeuN 最 低 為（14.06±3.52）% ，見圖5。

2.7 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)IL-6、TNF-α蛋白表達情況

模型組大鼠受損脊髓組織內(nèi)IL-6、TNF-α蛋白表達較假手術(shù)組升高，實驗組大鼠受損脊髓組織內(nèi)IL-6、TNF-α 蛋白表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

<0.05），見表1。

表1 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)IL-6、TNF-α蛋白表達比較/± s

2.8 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)Nfr2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達情況

模型組大鼠受損脊髓組織內(nèi)Nfr2、NQO1、HO-1 蛋白表達較假手術(shù)組升高，實驗組大鼠受損脊髓組織內(nèi)Nfr2、NQO1、HO-1 蛋白表達較模型組組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

<0.05），見表2，圖6。

圖6 受損脊髓組織內(nèi)Nfr2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達條帶圖

表2 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)Nfr2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達比較/± s

2.9 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)GFAP、NeuN 蛋白表達情況

模型組大鼠受損脊髓組織內(nèi)GFAP 蛋白表達較假手術(shù)組升高，NeuN蛋白表達較假手術(shù)組降低；實驗組大鼠GFAP 蛋白表達比模型組下降，NeuN 蛋白表達比模型組上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

<0.05），見表3，圖7。

圖7 受損脊髓組織內(nèi)GFAP、NeuN蛋白表達條帶圖

表3 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)GFAP、NeuN蛋白表達比較/± s

2.10 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達情況

模型組受損脊髓組織內(nèi)Bcl-2 蛋白表達較假手術(shù)組降低，Bax 蛋白、Caspase-3 蛋白及Cleaved Caspase-3 蛋白表達較假手術(shù)組升高；實驗組受損脊髓組織內(nèi)Bcl-2 蛋白表達較模型組升高，Bax 蛋白、Caspase-3蛋白及Cleaved Caspase-3蛋白表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

<0.05），見表4，圖8。

圖8 受損脊髓組織內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠受損脊髓組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達比較/± s

3 討論

SCI 可繼發(fā)局部脫髓鞘、神經(jīng)傳導(dǎo)纖維斷裂及少突膠質(zhì)細胞死亡等變化，造成機體神經(jīng)功能缺失。神經(jīng)元無法再生，且SCI 后機體內(nèi)局部微環(huán)境對軸突再生抑制，丟失神經(jīng)功能恢復(fù)困難。BMSCs作為多分化細胞，具有提取容易、分離純化簡單、體外擴增方便、分化潛能多向、移植排斥反應(yīng)小、無倫理學(xué)障礙等優(yōu)點，移植到機體內(nèi)在特定條件刺激下可分化為神經(jīng)元樣細胞。Woodbury 等首先報道了體外條件下經(jīng)生物與化學(xué)誘導(dǎo)物使BMSCs 轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元。相關(guān)研究顯示，BMSCs 可抑制受損部位氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)，為軸突再生提供基本骨架和有效連接，同時可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，為修復(fù)受損神經(jīng)提供良好微環(huán)境，降低神經(jīng)細胞凋亡。動物實驗研究顯示，受損模型移植BM?SCs 后，可遷移到壞死區(qū)域內(nèi)填充囊性區(qū)，使脊髓空洞面積減少，有效阻止膠質(zhì)瘢痕擴大，同時在局部微環(huán)境影響下可定向分化成神經(jīng)元細胞與膠質(zhì)細胞加速神經(jīng)元軸突再生；少突膠質(zhì)細胞能夠使脫髓鞘軸突重新髓鞘化，局部神經(jīng)回路得以重建，代償受損細胞功能。

SCI 主要病理過程之一為氧化應(yīng)激反應(yīng)，HO、-OH及O·等活性氧自由基分子直接氧化脂質(zhì)分子、NDA 等，造成分子結(jié)構(gòu)重飾或分子降解等一系列毀滅性事件與分子失活。脊髓組織內(nèi)氧化代謝中神經(jīng)元為活躍狀態(tài)，但神經(jīng)元抗氧化能力及再生能力有限，造成積累活性氧代謝產(chǎn)物及產(chǎn)生誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。上述因素會導(dǎo)致和一氧化氮相關(guān)生化紊亂，外界理化因素更易傷害神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元。Nrf2/HO-1 信號通路為重要抗氧化應(yīng)激通路，HO-1蛋白主要影響為抗代謝使調(diào)和抗氧化應(yīng)激。本文研究顯示，BMSCs 移植所介導(dǎo)的Nrf2/HO-1 信號通路可保護神經(jīng)元免受損傷，而HO-1 起到要關(guān)鍵影響，有研究顯示HO-1 在細胞外和細胞內(nèi)均可發(fā)揮保護影響，同時，HO-1 為HO誘導(dǎo)氧化損傷內(nèi)預(yù)防氧化應(yīng)激主要效應(yīng)物。細胞凋亡為SCI后繼發(fā)性損傷，是不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制調(diào)節(jié)程序性細胞死亡過程，在神經(jīng)元凋亡中Bcl-2、Bax 及Caspase蛋白有重要影響。本文研究顯示，實驗組受損脊髓組織內(nèi)Bcl-2 蛋白表達較模型組升高，Bax 蛋白、Caspase-3 蛋白及Cleaved Caspase-3 蛋白表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明BMSCs 移植對細胞凋亡信號通路有抑制作用。

SCI 病理后期，機體內(nèi)再生神經(jīng)軸突會形成膠質(zhì)瘢痕阻礙及Wallerian 變性，且病灶位置活化星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)增生，突起增多并延伸參與吞噬。清除受損區(qū)域后該空隙被星形膠質(zhì)細胞突起所填補，為化學(xué)性或機械性屏障而阻礙神經(jīng)再生。產(chǎn)生膠質(zhì)瘢痕后對微血管形成與延伸阻滯，同時小血管收縮對局部血供造成影響。另外，伴隨反應(yīng)性膠質(zhì)細胞的形成可同時產(chǎn)生大量一氧化氮，造成NDA 毒性變化使神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性壞死。本文研究顯示，實驗組GFAP 蛋白表達比模型組下降，NeuN 蛋白表比較模型組上升，說明BMSCs 移植可保護脊髓神經(jīng)元可免于壞死同時對星形膠質(zhì)細胞激活抑制。SCI 后細胞因子和炎癥因子激活了免疫細胞與星形膠質(zhì)細胞，加速并維持炎癥反應(yīng)。IL-6 與TNF-α 可誘導(dǎo)SCI 后期少突膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元死亡，造成感覺與運動神經(jīng)元功能障礙，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)。本文研究顯示，驗組大鼠受損脊髓組織內(nèi)IL-6、TNF-α蛋白表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明BMSCs移植能夠降低炎癥反應(yīng)對組織的損傷。

綜上所述，BMSCs 移植可抑制SCI 大鼠星形膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)細胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，加速恢復(fù)運動神經(jīng)功能，其作用機制可能和Nrf2/HO-1信號通路激活有關(guān)。由于時間和人力等條件限制，本研究中部分數(shù)據(jù)難免存在偏頗，且對Nrf2/HO-1信號通路的具體影響機制未明確，今后將進一步學(xué)習(xí)相關(guān)的知識以進行更大樣本量、更深入的探究。