胃癌組織中溶酶體相關(guān)四次跨膜蛋白B、三葉因子家族1表達(dá)與胃癌的關(guān)系

宋鐵英，李瑩瑩，郭娟

胃癌是消化系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其已經(jīng)成為臨床上威脅病人生存預(yù)后的重要疾病。在長(zhǎng)期飲酒或者幽門(mén)螺桿菌感染的人群中，胃癌的發(fā)病率顯著上升。臨床上通過(guò)對(duì)于胃癌發(fā)病機(jī)制的研究，可以為胃癌的診斷及治療預(yù)后的預(yù)測(cè)提供參考指標(biāo)。溶酶體相關(guān)四次跨膜蛋白B（lysosomeassociated protein transmembrane 4 beta ，LAPTM4B）是細(xì)胞器相關(guān)的跨膜蛋白，可以影響癌細(xì)胞的異常分裂速度，使其加快，使得癌細(xì)胞增殖穩(wěn)定性受到影響，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生；三葉因子家族（trefoil factor family，TFF）是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)因子，它激活轉(zhuǎn)錄上游的開(kāi)放閱讀區(qū)會(huì)增加癌細(xì)胞持續(xù)核分裂的風(fēng)險(xiǎn)。為了揭示LAPTM4B、TFF1 蛋白的表達(dá)與胃癌病人的病情關(guān)系，本研究收集80例胃癌組織，探討LAPTM4B、TFF1 蛋白的表達(dá)情況，并分析LAPTM4B、TFF1 蛋白的表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年8 月至2018 年6 月鄭州人民醫(yī)院病理科收集的胃癌組織80 例，男44 例、女36 例，年齡（61.2±8.6）歲，年齡范圍為47～75 歲；TNM 分期：Ⅰ期20 例、Ⅱ期27 例、Ⅲ期29 例、Ⅳ期4例；組織學(xué)分化程度：高分化23 例、中分化26 例、低分化28例、未分化3例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；浸潤(rùn)深度達(dá)到漿膜層31 例；病灶最大徑≥3.0 cm 45 例。選取距離胃癌病灶邊緣2～5 cm 的癌旁組織40 例，男20 例、女20 例，年齡（60.8±9.2）歲，年齡范圍為50～73 歲。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

診斷標(biāo)準(zhǔn)：胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第七版中的標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)病理學(xué)或胃鏡活檢證實(shí)；②病人不具有放化療等治療病史；③各項(xiàng)基礎(chǔ)資料完整；④病人或其近親屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性胃癌；②伴有風(fēng)濕免疫性疾病；③關(guān)鍵資料缺失，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色

使用石蠟切片。 脫水后室溫孵育20 min。磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，每次5 min。磷酸鹽緩沖液稀釋山羊血清，封閉抗體5 min。加入一抗（購(gòu)自賽默飛中國(guó)，濃度：1∶1 000）5 mL，37 ℃孵育2 h，或4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液洗3 次，每次5 min，加入生物素?zé)晒鈽?biāo)記二抗（購(gòu)自賽默飛中國(guó)，濃度：1∶2 000）3 mL，37 ℃孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液洗3 次，每次5 min，加入Streptavidin/HRP 辣根酶標(biāo)記streptavidin，37 ℃孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min，用增強(qiáng)型HRP-DAB 底物顯色試劑盒（PA110）顯色，自來(lái)水沖洗，復(fù)染，封固。

1.3.2 LAPTM4B、TFF1染色結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

LAPTM4B蛋白在癌組織的細(xì)胞質(zhì)中，TFF1蛋白在癌組織的細(xì)胞核中，顯微鏡下觀察時(shí)如果蛋白呈黃色、棕黃色、褐色則可判定為陽(yáng)性。①依據(jù)蛋白染色情況進(jìn)行評(píng)分：無(wú)著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）、褐色、黑色等深色（3 分）。②依據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞在總細(xì)胞中所占比例進(jìn)行評(píng)分：≤10%（1 分）、>10%～50%（2分）、>50%～75%（3分）、>75%（4分），兩種類(lèi)型的積分相乘為總分，總分<3 分為陰性、總分≥3 分為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組LAPTM4B 蛋白、TFF1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

胃癌組織中LAPTM4B 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率61.25%、TFF1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率68.75%，胃癌癌旁組織中LAPTM4B 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率25.00%、TFF1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率35.00%；胃癌組織均高于癌旁組織（

P

<0.05），見(jiàn)表1、圖1，2。

表1 胃癌組織與癌旁組織中的溶酶體相關(guān)四次跨膜蛋白B（LAPTM4B）、三葉因子家族1（TFF1）蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較/例（%）

2.2 LAPTM4B 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

在TNM 分期（Ⅲ期+Ⅳ期）、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中LAPTM4B 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.79%、74.42%，高于TNM 分期（Ⅰ期+Ⅱ期）48.94%、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45.95%（

P

<0.05）；LAPTM4B蛋白陽(yáng)性與陰性病人的病灶最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 溶酶體相關(guān)四次跨膜蛋白B（LAPTM4B）蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌參數(shù)的關(guān)系

2.3 TFF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

在TNM 分期（Ⅲ期+Ⅳ期）、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化的胃癌組織中TFF1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.91%、81.40%、87.10%，高于TNM 分期（Ⅰ期+Ⅱ期）53.19%、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54.05%、高分化和中分化的57.14%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）；TFF1蛋白陽(yáng)性與陰性病人的病灶最大徑、腫瘤浸潤(rùn)深度比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三葉因子家族1（TFF1）蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌參數(shù)的關(guān)系

3 討論

胃癌具有較高的基礎(chǔ)發(fā)病率和年病死率，其整體臨床預(yù)后不佳。胃癌臨床治療方案以及病人預(yù)后評(píng)估的參考依據(jù)均來(lái)自胃癌臨床病理特征。腫瘤蛋白如糖鏈蛋白125或者糖鏈蛋白199，雖然能夠在胃癌的診療中發(fā)揮臨床病情評(píng)估作用。但糖鏈蛋白125 或者糖鏈蛋白199 評(píng)估胃癌臨床病情的可靠性較低。

LAPTM4B蛋白是細(xì)胞膜跨膜調(diào)控相關(guān)因子，可以降低癌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，這與LAPTM4B 蛋白具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白的作用密不可分。癌細(xì)胞膜內(nèi)層蛋白LAPTM4B 蛋白的活化可增加癌細(xì)胞第二信使的活化，增加惡性腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控紊亂風(fēng)險(xiǎn)；TFF1 蛋白是三葉因子調(diào)控的成員，它修飾轉(zhuǎn)錄閱讀區(qū)的重復(fù)羧基結(jié)構(gòu)，可以增加癌基因異常轉(zhuǎn)錄的風(fēng)險(xiǎn)。研究揭示了TFF1 蛋白在胃癌病人中的表達(dá)。 認(rèn)為胃癌病人TFF1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高，但對(duì)LAPTM4B蛋白的分析較少。

本研究在研究免疫組織化學(xué)相關(guān)結(jié)論的過(guò)程中，可以發(fā)現(xiàn)在胃癌病灶組織中，LAPTM4B 蛋白、TFF1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于胃癌癌旁組織，表明LAPTM4B 蛋白、TFF1蛋白的高表達(dá)，可能在胃癌的整體性病情進(jìn)展中發(fā)揮了作用。從癌旁組織到癌組織的病變過(guò)程中，LAPTM4B 蛋白、TFF1 蛋白誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的惡化，或者通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞浸潤(rùn)和黏附能力的增強(qiáng)，能夠促進(jìn)惡性腫瘤病灶的形成。張靜怡等發(fā)現(xiàn)，在胃癌等胃腸道腫瘤病人中，LAPTM4B 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率可超過(guò)50%。在具有腹腔轉(zhuǎn)移或者胸腔積液、腹水的病人中，LAPTM4B蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率可進(jìn)一步上升。通過(guò)本研究免疫組織化學(xué)染色分析可見(jiàn)，LAPTM4B蛋白、TFF1 蛋白在病灶組織中具有較高的染色強(qiáng)度，其中在癌細(xì)胞異型性較為明顯的區(qū)域，LAPTM4B蛋白、TFF1 蛋白的染色深度更為明顯。本研究探討LAPTM4B 蛋白和TFF1蛋白的表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，在TNM 分期晚期或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人中，LAPTM4B 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較高，提示LAPTM4B 蛋白對(duì)胃癌病人臨床病理特征的影響是有效的。這主要由于LAPTM4B 蛋白的高表達(dá)能夠通過(guò)提高胃黏膜上皮細(xì)胞偽足形成的能力，這將使得癌細(xì)胞黏附淋巴組織的風(fēng)險(xiǎn)提高，加速了病理學(xué)的進(jìn)展。特別是LAPTM4B 對(duì)于淋巴結(jié)內(nèi)皮黏附分子adherin 的表達(dá)調(diào)控，能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)于淋巴結(jié)組織的黏附浸潤(rùn)能力；而在不同TNM 分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同分化程度的胃癌組織中，TFF1 蛋白的表達(dá)同樣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TFF1 蛋白也能夠影響到胃黏膜上皮細(xì)胞的病變過(guò)程，這主要由于TFF1 蛋白能夠影響到腫瘤細(xì)胞內(nèi)MAPK 或者P16 信號(hào)通路的激活，最終加劇了癌細(xì)胞生物學(xué)行為的惡化。特別是TFF1 蛋白能夠通過(guò)影響到腫瘤細(xì)胞分化成熟誘導(dǎo)因子cyc，導(dǎo)致胃癌上皮細(xì)胞定向分化障礙，導(dǎo)致低分化比例的胃癌細(xì)胞明顯增加。

綜上所述，胃癌組織中LAPTM4B、TFF1 表達(dá)強(qiáng)度明顯較癌旁組織增強(qiáng)，可能與胃癌的發(fā)生及發(fā)展有一定的關(guān)系。關(guān)于LAPTM4B、TFF1 的表達(dá)與胃癌病人臨床轉(zhuǎn)歸或者臨床預(yù)后的關(guān)系，仍然需要后續(xù)研究的探討。