反向高效液相色譜法檢測正心降脂片中丹參酮ⅡA、葛根素和大黃素含量

曲春雁，崔國方，范廣慈，張濟濤

正心降脂片系由羊紅膻、決明子、陳皮、何首烏、黃芪、丹參、葛根、槐米等八味藥材制成的中成藥，其具有益氣活血，祛痰降濁等功效，臨床主要治療氣虛血瘀、痰濁蘊結(jié)所致的胸痹、心痛、頭痛、眩暈等病癥；現(xiàn)階段，我國人口老齡化趨勢越發(fā)明顯，許多老年人患有高血脂、高血壓、心臟病，嚴重威脅老年人的身心健康，正心降脂片在臨床應(yīng)用較廣，因此加強對該中藥品種的質(zhì)量控制，有利于保障病人的用藥安全；正心降脂片現(xiàn)收載于2015版《中國藥典》中，標準中含量測定項采用高效液相色譜法監(jiān)測該產(chǎn)品葛根藥材，即葛根素含量，對于其他藥材無含量測定，為提高該產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平，本研究2020 年3―5 月建立RP-HPLC 法檢測正心降脂片中丹參酮ⅡA、葛根素和大黃素3種成分含量的分析方法，為進一步完善和提高該品種的質(zhì)量標準提供技術(shù)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 infinity 型高效液相色譜儀，配備自動進樣器、DAD 檢測器、Open-lab 工作站（美國安捷倫科技公司）；Lichrospher RP-C液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技公司）；賽多利斯QUINTIX2102-1CN 型電子分析天平（德國賽多利斯科技公司）；KQ-3200 型超聲波清洗器（容積10 L，昆山超聲設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

丹參酮Ⅱ?qū)φ掌罚ň幪?10766-201721，含量以99.5% 計）；葛根素對照品（編號110752-201816，含量以95.4% 計）；大黃素對照品（編號110756-201913，含量以96.0% 計），均購自中國食品藥品檢定研究院；正心降脂片（西安正大制藥有限公司，規(guī)格為每片重0.31 g，批次1911013，1912041，2001018）；甲醇、乙腈：色譜純，購自美國TEDIA 試劑公司；磷酸：分析純，購自國藥集團上?；瘜W試劑廠；水：去離子水，純水儀制備；其他試劑：分析純購自國藥集團上海化學試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

液相色譜柱：Lichrospher RP-C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長：259 nm，流動相A：乙腈，流動相B：0.2% 磷酸溶液（準確移取2 mL濃磷酸，加純化水至1 000 mL，超聲混勻，即得），梯度洗脫，洗脫程序：0～6 min 12% A，6～15 min 12%～63% A，15～25 min 63%～92% A，25～27 min 91%A，27～30 min 91% ～12% A，30～35 min 12% A；流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進樣體積：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品儲備溶液

取葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ?qū)φ掌?，精密稱定，置同一個100 mL 容量瓶中，加95% 甲醇溶液制成每1 mL 溶液中含葛根素0.763 mg、大黃素0.768 mg 和丹參酮Ⅱ0.199 mg 的混合溶液，搖勻，即得對照品儲備溶液。

2.2.2 對照品溶液

取2.2.1對照品儲備溶液，精密移取1.0 mL，置100 mL 容量瓶中，加95% 甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

取正心降脂片10 片，除去包衣，研細，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加95% 甲醇溶液30 mL，超聲處理25 min（超聲功率300 W，頻率50 kHz），取出，冷卻至室溫，加95% 甲醇溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液

按正心降脂片藥材配比和加工處理方法，分別制備缺葛根、何首烏和丹參的陰性樣品和同時缺3 種藥材的陰性對照樣品，分別按2.2.3供試品溶液處理，制得缺對應(yīng)藥材的陰性溶液和陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察

取2.2 溶液制備項下“2.2.2”對照品溶液、“2.2.3”供試品溶液和“2.2.4”陰性對照溶液，按2.1 色譜條件注入色譜儀各10 μL，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液與對照品溶液中葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ色譜峰保留時間一致，3種待測成分分離良好，陰性對照溶液無干擾峰存在，表明方法專屬性良好。

圖1 典型色譜圖：A為對照品溶液；B為供試品溶液；C為陰性對照溶液；D為空白試劑溶液；E為缺葛根的陰性溶液；F為缺大黃的陰性溶液；G為缺丹參的陰性溶液

2.3.2 精密度試驗

取2.2 溶液制備項下“2.2.2”對照品溶液，按2.1 色譜條件注入色譜儀10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。根據(jù)色譜圖中葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ峰面積計算相對標準偏差（RSD）。結(jié)果葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ精密度RSD 分別為1.41%、1.08%和0.99%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取正心降脂片（ 批次1911013），按2.2.3 供試品溶液方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h，按2.1 色譜條件，每個點注入色譜儀10 μL，記錄色譜圖。根據(jù)色譜圖中葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ峰面積計算RSD。結(jié)果葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ穩(wěn)定性RSD分別為2.03%、1.72% 和1.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 線性關(guān)系考察

取2.2 溶液制備項下“2.2.1”對照品儲備溶液，精密移取適量，分別加95% 甲醇溶液定容至刻度制備含葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ系列標準曲線溶液，按2.1 色譜條件分別注入色譜儀10 μL，記錄色譜圖。以葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ響應(yīng)值為縱坐標（Y），對應(yīng)濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，計算曲線方程。結(jié)果3 種待測成分線性曲線良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。見表1。

表1 3種成分線性關(guān)系結(jié)果

2.3.5 加標回收考察

取已測定葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ含量的正心降脂片（批次1911013、191012）10 片，除去包衣，研細，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，同法稱取6 份，分別精密加入2.2溶液制備項下“2.2.1”對照品儲備溶液適量，后續(xù)按2.2.3 供試品溶液處理，制備6 份加標溶液，按2.1色譜條件分別注入色譜儀10 μL，記錄色譜圖。根據(jù)檢測量和實際加入量計算加標回收率。結(jié)果見表2，三種待測成分的平均加標回收率分別為98.5%、99.3%和99.6%，加標回收率結(jié)果良好。

表2 加標回收考察結(jié)果

2.3.6 重復性試驗

取同一批次正心降脂片（批次1911013）樣品，按2.2 溶液制備項下“2.2.3”供試品溶液方法，制備6 份供試品溶液，按2.1 色譜條件分別注入色譜儀10 μL，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積計算6 份供試品中葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ含量，并計算RSD。結(jié)果葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ重復性RSD 分別為1.29%、2.05% 和1.72%，表明方法重復性良好。

2.4 驗證試驗

取正心降脂片（批次1911013、1912041、2001018），按2.2 溶液制備項下“2.2.3”供試品溶液方法，分別制備供試品溶液，每份供試品平行配制3 份；按2.1 色譜條件分別注入色譜儀10 μL，記錄色譜圖。計算3 份供試品中葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ的含量。檢測結(jié)果見表3。由表3可以看出，3 個批次樣品檢測均檢出葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ，方法優(yōu)于標準方法。

表3 正心降脂片供試品含量檢測結(jié)果/（毫克/片）

3 討論

3.1 待測成分的確定

正心降脂片系由羊紅膻、決明子、陳皮、何首烏、黃芪、丹參、葛根、槐米等八味藥材制成的中成藥，方中葛根有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)等功效，何首烏有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效，丹參有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，現(xiàn)行標準中以葛根藥材中葛根素為含量測定項，不能較全面的體現(xiàn)該產(chǎn)品的質(zhì)量水平，分析該品種藥材組成及活性成分紫外吸收情況，最終確定葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ作為待測成分。

3.2 檢測波長的選擇

取2.2 溶液制備項下“2.2.2”對照品溶液，按2.1 色譜條件注入色譜儀10 μL，設(shè)定光譜采集范圍在200～400 nm 之間，記錄色譜圖和光譜圖。結(jié)果分析葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ紫外光譜圖得知，葛根素在251 nm 處、大黃素在254 nm處、丹參酮Ⅱ在268 nm 處有最大吸收，結(jié)合3 種成分色譜圖響應(yīng)情況，確定259 nm 作為檢測波長。根據(jù)選定檢測波長，分別進樣2.2 溶液制備項下“2.2.2”對照品溶液、“2.2.3”供試品溶液和“2.2.4”陰性對照溶液，結(jié)果，選擇該波長時，3 種活性成分響應(yīng)良好，定性、定量結(jié)果準確。

3.3 提取方法的優(yōu)化

正心降脂片系由羊紅膻等八味藥材制成的中成藥，藥味較多，基質(zhì)較為復雜，因此前處理方法的優(yōu)化，可以提高檢測效率、結(jié)果準確度等。取正心降脂片，按2.2 溶液制備項下“2.2.3”供試品溶液方法，分別選擇甲醇、95% 甲醇溶液、85% 甲醇溶液和75% 甲醇溶液作為提取溶劑時，對葛根素、大黃素和丹參酮Ⅱ提取情況和檢測結(jié)果的影響，結(jié)果選擇95% 甲醇溶液作為提取劑時，提取效果最優(yōu)；再分別考察超聲功率和時間的影響，最終確定95% 甲醇溶液作為提取溶劑，超聲功率控制300 W，時間控制25 min為最佳條件。

綜上，實驗研究建立了RP-HPLC 法檢測正心降脂片中丹參酮Ⅱ、葛根素和大黃素3 種成分含量的分析方法，對該方法的線性、精密度等進行了系統(tǒng)的考察，并對市售樣品進行了檢測，結(jié)果證明，該方法適用于正心降脂片產(chǎn)品的質(zhì)量控制，為進一步完善和提高該品種的質(zhì)量標準提供技術(shù)參考，為臨床用藥安全提供技術(shù)保障。