右美托咪定在體外對原代海馬神經(jīng)元氧化應激損傷的影響

代娟，張敏

氧化應激廣泛的存在于機體的各種病理生理過程，其廣泛地定義為自由基的過度表達，許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展都與其有很多聯(lián)系。而氧化損傷對于海馬神經(jīng)元來說又是一種修復困難的病理生理過程，當機體失去正常的生理代謝平衡，氧化損傷隨即產(chǎn)生，尤其對腦部的氧化應激可能會導致認知功能障礙等。很多研究表明，術后認知功能障礙、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）等多種神經(jīng)退行性疾病都與海馬神經(jīng)元的氧化應激有關。

右美托咪定是一種高度選擇性α受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗交感等藥理作用。有研究表明，右美托咪定可以減輕藥物對大腦的損害，從而減少大腦的功能改變，這種保護作用可能與ERK1/2 信號通路及上游BDNF 等有關，但具體機制不明。鑒于此，本研究自2019 年3―7 月通過觀察合適濃度的右美托咪定對體外原代海馬神經(jīng)元氧化應激的影響，探討其減弱氧化應激的機制，為右美托咪定在臨床中的應用提供相關基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

新生SD 大鼠，出生24 h 以內(nèi)，軍事醫(yī)學科學院動物中心提供［SCXK（京）：2013-0001］，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食水，室溫20～25 ℃，濕度50 %；鹽酸右美托咪定（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號H20090248，批次10061434）；DMEM 干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、多聚賴氨酸、阿糖胞苷均為Sigma 公司產(chǎn)品；馬血清、胎牛血清、微量轉(zhuǎn)鐵蛋白（MTF）、考馬斯藍G-250（Hyclone、Amersco）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）相關試劑購（Thermo Fish?er）等。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2 原代海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)

將新生24 h 內(nèi)的SD大鼠斷頭，解剖顯微鏡下分離取出海馬神經(jīng)元組織；胰蛋白酶消化15 min，加終止液終止消化10 min，1 100 r/min 離心5 min，棄去上清。加入含血清培養(yǎng)液，過濾，細胞計數(shù)，活細胞終濃度為5×10/mL，然后將細胞懸液分別種植到96 孔板、6 孔板中，置于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，將種植液吸出，加入相同量含血清飼養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后換液，并加入終濃度為10 μmol/L 阿糖胞苷（arabinofuranoside，Ara-C）。48 h 后，將有血清飼養(yǎng)液全部吸出，用DMEM 培養(yǎng)液洗滌細胞2次，然后加入無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d 半量換液；每天觀察細胞的生長情況，直到海馬神經(jīng)元培養(yǎng)到10 d，備用造模。

1.3 實驗分組及處理

將培養(yǎng)10 d 的海馬神經(jīng)細胞分為5 組（

n

=6）：（1）損傷對照組（S 組）：培養(yǎng)液中加入1 mmol/L 的 過氧化氫（HO）處理原代海馬神經(jīng)元1 h。（2）右美托咪定組（D 組）：在加入HO前8 h，分別加入0.001 μmol/L、0.1 μmol/L、10 μmol/L鹽酸右美托咪定，然后用HO處理，時間1 h。（3）空白對照組（C 組）：處理步驟同前兩組，每次處理物質(zhì)為相同量的培養(yǎng)液。觀察各項指標的變化。

1.4 神經(jīng)細胞存活率測定

將20 μL 噻唑藍（MTT）溶液（5 mg/mL）加入到各孔中，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)4 h。棄原液，然后加入150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，采用酶標儀490 nm 波長檢測光密度（optical density，OD）值，并根據(jù)各組OD 值計算細胞存活率。海馬神經(jīng)元存活率（%）=（測定組OD值/空白對照組OD值）×100%。

1.5 神經(jīng)細胞損傷的測定測定

將經(jīng)過處理的海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7 d后，按LDH測定試劑盒說明書要求測定LDH活力（北京雷根生物技術有限公司）。

1.6 MDA 含量、SOD 活性檢測

將經(jīng)過處理的海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7 d 后，用0.25%胰酶消化，然后將細胞移入離心管，1 100 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液。用生理鹽水將細胞沉淀制成1×10cells/mL 的細胞懸液后，分別按照MDA、SOD 測定試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）說明書的要求測定MDA含量、SOD活性。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法測量各組ERK1/2和BNDF mRNA 表達量

將經(jīng)過處理的海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7 d 后，采用RT-PCR 技術檢測海馬神經(jīng)元細胞中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2 和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BNDF）mRNA 表達變化，反應體系試劑2×Premix Type 10 μL、50×Rox Refer?ence Dye Ⅱ0.2 μL、引物0.5 μL、探針0.8 μL、DdH2O 5.2 μL，引物及探針序列見表1。

表1 內(nèi)源性肌動蛋白（ACTB）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BNDF）基因的引物及探針序列

PCR 反應條件：95 ℃3 min，95 ℃15 s，56 ℃20 s，65 ℃40 s，共40 個循環(huán)。實驗設置3 個重復孔。RT-PCR 對每個樣本均進行了3 次重復試驗。擴增結果判定：利用Quantity One 系統(tǒng)軟件檢測各組mRNA表達量。

2 結果

2.1 右美托咪定對細胞存活率的影響

損傷對照組海馬神經(jīng)細胞存活率（51.04±2.12）%與空白對照組（98.62±0.96）%比較，顯著下降（

P

<0.01），右美托咪定組細胞存活率較損傷對照組有所提高（

P

<0.05），但與空白對照組比較，仍呈下降（

P

<0.05）。在右美托咪定組中，0.1 μmol/L 右美托咪定組的細胞存活率為（89.34±2.56）%，與0.001 μmol/L 右美托咪定組的（72.13±2.45）%及10 μmol/L 右美托咪定組的（78.40±2.60）%細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義（

P

<0.05），提示過高或者過低濃度的右美托咪定對海馬神經(jīng)細胞的保護作用都會有影響。

2.2 右美托咪定對細胞上清液LDH 活性的影響

各組通過LDH 試劑盒測定的細胞上清液中LDH 活性，結果顯示，與空白對照組比較，損傷對照組上清液LDH 活性顯著上升［（9.42±1.25）U/L 比（3.11±0.52）U/L］（

P

<0.01），右美托咪定組海馬神經(jīng)細胞上清液LDH 活性較損傷對照組有所下降（

P

<0.05），但與空白對照組上清液LDH 活性相比較，仍呈上升，兩者差異有統(tǒng)計學意義（

P

<0.05）。在右美托咪定組中，0.1 μmol/L 右美托咪定組的上清液LDH 活性最低，為（5.10±0.98）U/L，顯著低于損傷對照組（

P

<0.05），及0.001 μmol/L、10 μmol/L 右美托咪定組的上清液LDH 活性［（7.86±1.12）U/L、（6.98±1.06）U/L］（

P

<0.05），進一步證實過高或者過低濃度的右美托咪定對海馬神經(jīng)細胞的保護作用都會有影響。

2.3 右美托咪定對細胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

與空白對照組比較，損傷對照組原代海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)MDA含量顯著增多，SOD 活性顯著下降（

P

<0.05）；0.1 μmol/L右美托咪定組MDA 含量較損傷對照組顯著減少（

P

<0.05），SOD 活性顯著升高（

P

<0.05），而與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（

P

<0.05）。見表2。

表2 各組原代海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）測定結果/± s

2.4 右美托咪定對細胞ERK1/2 和BNDF mRNA表達量的影響

與空白對照組相比，損傷對照組原代海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK1/2 和BNDF mRNA 表達明顯升高（

P

<0.01）；0.1 μmol/L 右美托咪定組ERK1/2 和BNDF mRNA 表達較損傷對照組顯著提高（

P

<0.01）。見表3。

表3 各組原代海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ERK1/2和BNDF mRNA表達量/± s

3 討論

大腦是人重要的器官，但也是較為脆弱的器官之一，具有灌注高、耗氧高、代謝高而耐受偏低的特點，對氧化應激反應的耐受較其他器官低很多，然而，氧化應激卻是神經(jīng)元細胞受到損傷的重要的病理生理過程，此過程由過多的氧化自由基來執(zhí)行，當細胞內(nèi)自由基含量超過細胞自身的清除能力時，過多的自由基可破壞脂質(zhì)和細胞膜及產(chǎn)生蛋白、核酸等，造成氧自由基損傷。研究提示，在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病中氧化應激起非常重要的作用。有文獻報道，HO可直接損傷細胞膜，使膜脂類和蛋白質(zhì)發(fā)生過氧化反應。而利用低濃度HO可以建立原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞凋亡模型。

合理的應用藥物干預神經(jīng)細胞氧化應激反應，對保護神經(jīng)細胞功能具有非常重要的意義。有研究表明，目前有多種麻醉藥物具有神經(jīng)保護的功能。右美托咪定目前臨床應用較為廣泛的麻醉藥，其主要作用于腦和脊髓的α腎上腺素受體。在臨床麻醉中，右美托咪定既可以作為麻醉前用藥，又可以作為全身麻醉、局部麻醉的輔助用藥。有研究表明，右美托咪定具有神經(jīng)保護功能，這種功能可能通過減輕缺血缺氧以及藥物對大腦的損害而實現(xiàn)。

本研究觀察了不同劑量右美托咪定具有減輕原代海馬神經(jīng)元細胞的氧化應激后神經(jīng)損傷的作用。本研究結果顯示，適宜濃度的右美托咪定能夠顯著提高海馬元代神經(jīng)元細胞的存活率，并能夠使細胞上清液中LDH 活性降低，提示其對原代海馬神經(jīng)細胞的氧化損傷有一定拮抗作用，可能與其促進抑制細胞凋亡的基因表達有關。但當右美托咪定的濃度繼續(xù)上升時，這種作用未見明顯的增強，甚至出現(xiàn)負向變化。本研究中0.001 μmol/L、10 μmol/L右美托咪定組的細胞存活率和上清液LDH活性較0.1 μmol/L 右美托咪定組存在明顯差異，證實過高或者過低濃度的右美托咪定對海馬神經(jīng)細胞的保護作用都會有影響，具體機制有待進一步的研究證明。

丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性可以很好的反應機體氧化損傷水平，本研究發(fā)現(xiàn)，在加入右美托咪定后，海馬神經(jīng)細胞內(nèi)丙二醛含量顯著降低，同時超氧化物歧化酶的活性大幅提升，從而使其抗氧化能力增強，這些變化可能與右美托咪定可減弱原代海馬神經(jīng)元細胞氧化應激損傷的作用有關。

右美托咪定通過作用于海馬組織神經(jīng)元突觸前膜上的α受體，促使去甲腎上腺素釋放減少，最終導致ERK1/2、BNDF 表達增加，從而對體外原代海馬神經(jīng)元細胞的氧化應激損傷產(chǎn)生保護作用。本研究結果也表明，與損傷對照組相比，0.1 μmol/L右美托咪定組ERK1/2、BNDF 表達量升高，從一定程度上間接證明適宜劑量的右美托咪定有可能是通過ERK1/2、BNDF 信號通路發(fā)揮作用的。介于本實驗的設計，蛋白表達產(chǎn)物未列入測定，待后續(xù)的研究中將進一步完善。

本研究表明，適宜劑量的右美托咪定對海馬神經(jīng)元的氧化應激損傷有一定的保護作用，其作用機制可能與其能夠提升海馬神經(jīng)細胞的抗氧化能力，從而抑制海馬神經(jīng)元的凋亡有關，這種功能可能ERK1/2 和BNDF 信號通路有關。有關其神經(jīng)保護作用的具體詳細作用機制還待進一步研究。