柚皮素對體外糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成的抑制作用及機制

湯澎，趙娟，楊光

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是導(dǎo)致成人致盲的關(guān)鍵原因，大部分患者晚期預(yù)后較差。根據(jù)嚴(yán)重程度，DR 分為增殖性（PDR）與非增殖性（NPDR）兩種類別，其中，以視網(wǎng)膜新生血管為特征的PDR 對患者造成的損傷最為嚴(yán)重。DR的病理機制十分復(fù)雜，多種因素參與其中。近年來，針對DR 的藥物治療取得了較大進(jìn)展，最主要的是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）拮抗劑，但它需要眼內(nèi)重復(fù)注射，費用高，易復(fù)發(fā)，且長期的生物安全性還有待觀察。因此，尋找安全有效防治視網(wǎng)膜新生血管的藥物具有重要的醫(yī)學(xué)和社會意義。

柚皮素是柚皮苷的苷元，是一種廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物中的二氫黃酮類化合物。研究顯示，柚皮素具有抗炎、清除自由基、抑制過氧化，降血脂以及抑制腫瘤生長等作用，顯示出巨大的藥用價值。眼科領(lǐng)域的研究顯示，柚皮素可在體外抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長，具有抑制大鼠脈絡(luò)膜新生血管的能力。然而，柚皮素對DR 的視網(wǎng)膜新生血管形成的影響還鮮見報道?；诖耍狙芯孔?019年3―9月采用高糖誘導(dǎo)的RF/6A為模型，評價柚皮素對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RF/6A 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25% 胰酶，胎牛血清購自美國Gibco 公司；柚皮素購自美國Sigma 公司；LC3、mTOR、GAPDH 抗體及HRP 標(biāo)記二抗購自美國Cell signaling 公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室和Matrigel購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理及分組

將RF/6A 細(xì)胞置于含有10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、飽和濕度下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以每孔5.0×10個細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，貼壁后按隨機數(shù)字表法分組并處理細(xì)胞：對照組在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，高糖組在DMEM 培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖、高糖+柚皮素組在DMEM 培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖及3 mg/L柚皮素。

1.2.2 細(xì)胞增殖

將細(xì)胞以10～10個/孔的密度在96 孔板中，每孔100 μL 培養(yǎng)基，含有或不含有待測化合物。根據(jù)不同分組處理細(xì)胞，然后在二氧化碳培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h。使用重復(fù)移液器向96 孔板的每個孔中加入10 μL CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4 h。在軌道振動器上輕輕混合10 min，使用酶標(biāo)儀測量450 nm 處的吸光度。細(xì)胞增殖率（%）=［（As－Ab）/（Ac－Ab）］×100。As 為實驗孔吸光度，Ab 為空白孔吸光度，Ac 為對照孔吸光度。

1.2.3 細(xì)胞遷移

以每孔5×10/個細(xì)胞將RF/6A 細(xì)胞接種至6 孔板中，37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。按照不同分組加藥處理24 h，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心去上清，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度至2×10個/毫升。在24 孔板中加入800 μL 含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，并放入Transwell 小室，在上室分別接入200 μL 各組細(xì)胞懸液，37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出Tran?swell 小室，清洗后用70% 冰乙醇固定細(xì)胞1 h。0.5% 結(jié)晶紫染色，室溫放置20 min，擦凈上室一側(cè)的未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照。每個小室隨機選取3個視野，對遷移的細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)。

1.2.4 管腔形成

將Matrigel 放于冰盒中，在4 ℃冰箱中過夜融化，并預(yù)冷槍頭和24 孔板。向24 孔板內(nèi)緩慢加入液態(tài)Matrigel，每孔200 μL，37 ℃孵育1 h。取不同分組的細(xì)胞，消化后用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，以每孔2×l0個將細(xì)胞接種到鋪好膠的24 孔板，37 ℃過夜后顯微鏡拍照，隨機取3 個放大100倍的視野，Image J軟件對血管腔進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

常規(guī)提取單層貼壁細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度和蛋白變性。制備電泳膠，將40 μg 等量總蛋白加樣到SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離。取出凝膠根據(jù)Marker 切下目的條帶，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。在室溫下用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉PVDF 膜2 h，用封閉液稀釋的一抗LC3、mTOR、p-mTOR 及GAPDH（均為1∶1 000）浸泡PVDF 膜，4 ℃孵育過夜。充分洗膜，用稀釋的HRP 標(biāo)記二抗浸泡PVDF 膜，37 ℃搖床孵育2 h。TBST 充分洗膜后ECL 顯色曝光，晾干、掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素促進(jìn)高糖下的細(xì)胞增殖

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，各組RF/6A細(xì)胞均有不同程度生長（圖1）。三組RF/6A 細(xì)胞的增殖率：對照組（99.43±0.07）%，高糖組（72.08±2.12）%，高糖＋柚皮素組（90.54±1.47）%。三組間的細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=246.35，

P

=0.000）；組間兩兩比較顯示，高糖組細(xì)胞增殖率比對照組減小（

t

=21.31，

P

=0.000），柚皮素增加高糖條件下的細(xì)胞增殖率（

t

=12.39，

P

=0.000）。以上結(jié)果提示，高糖條件下的RF/6A增殖明顯減弱，柚皮素對高糖下的細(xì)胞生長具有保護(hù)作用。

圖1 各組RF/6A細(xì)胞形態(tài)（×100）：A為對照組；B為高糖組；C為高糖＋柚皮素組

2.2 柚皮素抑制高糖下的細(xì)胞遷移

Transwell 實驗結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均發(fā)生不同程度的遷移。對照組、高糖組、高糖＋柚皮素組RF/6A細(xì)胞的遷移數(shù)分別為（120.33±6.03）、（149.00±9.17）、（76.33±5.51）個。統(tǒng)計比較顯示，三組間的細(xì)胞遷移數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=80.03，

P

=0.000）；組間兩兩比較顯示，高糖組細(xì)胞遷移數(shù)比對照組增加（

t

=4.53，

P

=0.011），柚皮素減少高糖條件下的細(xì)胞遷移數(shù)（

t

=11.77，

P

=0.000）（圖2）。以上結(jié)果提示，高糖下的RF/6A 遷移增強，柚皮素對高糖下的細(xì)胞遷移具有抑制作用。

圖2 各組RF/6A細(xì)胞遷移（結(jié)晶紫染色×200）：A為對照組；B為高糖組；C為高糖＋柚皮素組

2.3 柚皮素抑制高糖下的細(xì)胞管腔形成

Matrigel實驗結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均有管腔樣結(jié)構(gòu)的形成。對照組、高糖組、高糖＋柚皮素組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)分別為（11.00±1.00）、（17.33±2.52）、（7.67±1.53）個。統(tǒng)計比較顯示，三組間的細(xì)胞管腔形成數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=22.45，

P

=0.002）；組間兩兩比較顯示，高糖組細(xì)胞管腔形成數(shù)比對照組增加（

t

=4.05，

P

=0.015），柚皮素可減少高糖條件下的細(xì)胞管腔形成數(shù)（

t

=5.69，

P

=0.005）（圖3）。以上結(jié)果提示，高糖下的RF/6A 血管樣結(jié)構(gòu)形成增強，柚皮素對高糖下的細(xì)胞管腔形成具有抑制作用。

圖3 各組RF/6A細(xì)胞管腔形成（×100）：A為對照組；B為高糖組；C為高糖＋柚皮素組

2.4 柚皮素抑制高糖下的自噬激活

Western blot?ting 實驗結(jié)果顯示，對照組、高糖組、高糖＋柚皮素組RF/6A 細(xì)胞LC3-Ⅰ的相對表達(dá)量分別為（0.74±0.09）、（0.73±0.15）、（0.78±0.14），三組間比較總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=0.131，

P

=0.880）。對照組、高糖組、高糖＋柚皮素組RF/6A 細(xì)胞LC3-Ⅱ的相對表達(dá)量分別為（0.14±0.03）、（0.48±0.05）、（0.28±0.10），三組間比較總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=18.87，

P

=0.003）。組間兩兩比較顯示，高糖組LC-Ⅱ的表達(dá)比對照組增加（

t

=9.99，

P

=0.001），柚皮素可減少高糖條件下的LC-Ⅱ表達(dá)（

t

=3.13，

P

=0.035）（圖4）。以上結(jié)果提示，高糖下的RF/6A自噬增強，柚皮素對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬具有抑制作用。

圖4 各組RF/6A細(xì)胞LC3的蛋白表達(dá)

2.5 柚皮素抑制高糖下自噬激活的機制

Western blotting 實驗結(jié)果顯示，對照組、高糖組、高糖＋柚皮素組RF/6A 細(xì)胞mTOR 的相對表達(dá)量為（0.73±0.10）、（0.79±0.07）、（0.83±0.05），三組間比較總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=1.22，

P

=0.359）。對照組、高糖組、高糖＋柚皮素組RF/6A 細(xì)胞p-mTOR 的相對表達(dá)量為（0.69±0.09）（0.18±0.04）、（0.58±0.09），三組間比較總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=36.82，

P

=0.000）。組間兩兩比較顯示，高糖組p-mTOR的表達(dá)比對照組減少（

t

=9.39，

P

=0.001），柚皮素可增加高糖條件下的p-mTOR 表達(dá)（

t

=6.87，

P

=0.002）（圖5）。以上結(jié)果提示，高糖條件下mTOR 信號通路受到抑制，柚皮素可促進(jìn)高糖下mTOR 自噬信號通路的激活。

圖5 各組RF/6A細(xì)胞mTOR和p-mTOR的蛋白表達(dá)

3 討論

DR 的發(fā)病機制很復(fù)雜，臨床治療棘手，目前主要以防治視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生和抑制其發(fā)展為主。近年來，中藥抑制眼部新生血管形成已經(jīng)成為眼科藥物研究的熱點。酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，黃酮類化合物是在天然藥物中發(fā)現(xiàn)的主要酚類化合物。有研究顯示，多種黃酮類藥物有較強的抑制眼部新生血管的作用，如柚皮素、柚皮素、芹黃素等。早期對視網(wǎng)膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯示，柚皮素能夠促進(jìn)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長，同時對這兩種細(xì)胞均有抗氧化作用，認(rèn)為柚皮素是治療老年性黃斑變性的很有前景的候選藥物。本研究利用DR 的細(xì)胞模型，參考上述研究的柚皮素作用濃度，在體外首次觀察了柚皮素對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成的影響。結(jié)果提示，柚皮素對高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞存活與增殖具有保護(hù)作用，對細(xì)胞遷移和管腔形成具有明顯的抑制作用，即提示柚皮素能抑制DR 中視網(wǎng)膜新生血管的形成。

柚皮素廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物的果皮和果肉中，如葡萄皮、番茄皮、葡萄柚、橙、枸橘等。近年來，大量國內(nèi)外學(xué)者對柚皮素的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及其在氧化應(yīng)激、炎癥、癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用和在不同疾病中的治療作用進(jìn)行了研究。在細(xì)胞研究方面，Zygmunt 等發(fā)現(xiàn)柚皮素治療能通過增加AMPK 的活化增強L6 肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取。柚皮素可顯著降低3 T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖，且效應(yīng)呈劑量依賴性，伴隨乳酸脫氫酶（LDH）釋放量的增加而不影響甘油三酯的累積或脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪發(fā)生基因（PPAR-g 和STAT3）的表達(dá)。柚皮素處理人肝癌細(xì)胞HepG2 能明顯減少載脂蛋白B（ApoB）的累積和細(xì)胞膽固醇酯質(zhì)量，降低乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶2（ACAT2）mRNA 水平和微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運蛋白（MTP）的水平和活性，增加低密度脂蛋白（LDL）受體mRNA 水平及LDL 的攝取和降解。這些結(jié)果提示柚皮素的這些效應(yīng)可能會減弱體內(nèi)高血糖、高脂血癥和胰島素抵抗。觀察柚皮素對胰腺β 細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素處理大鼠胰腺INS-1E 細(xì)胞，增強了葡萄糖刺激的胰島素分泌和幾個β 細(xì)胞基因的表達(dá)，還能降低促凋亡標(biāo)志物mRNA 水平，提示柚皮素在β細(xì)胞中的作用可增加葡萄糖敏感性和防止β 細(xì)胞凋亡。動物實驗表明，在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病動物中應(yīng)用柚皮素可恢復(fù)血糖和血脂水平，減少糖尿病腎病，柚皮素給藥可產(chǎn)生抗炎和抗氧化作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，每天攝入柚皮素（5.0 mg/kg）可降低缺血性心臟病、腦血管疾病、特定癌癥和哮喘的死亡率，降低2 型糖尿病風(fēng)險。血液中柚皮素水平與肥胖、收縮壓、舒張壓呈負(fù)相關(guān)，與血清三酰甘油水平、腰圍、胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)，與血清高密度脂蛋白（HDL）水平呈正相關(guān)。每天給予柚皮素400 mg 8 周，高膽固醇血癥者的血漿總膽固醇和LDL 膽固醇降低，而HDL 和甘油三酯的濃度則不受影響。此外，柚皮素治療顯著降低ApoB 水平，顯著提高紅細(xì)胞SOD 和CAT 活性，降低GSH-Px 活性和血漿TBARS 水平。在另一項研究中，給超重個體服用含有柚皮素的柑橘多酚提取物（900 mg/kg）12 周，其體重和血糖水平顯著降低。

以上細(xì)胞、動物和臨床研究均證實，柚皮素對糖尿病及其并發(fā)癥具有治療作用，但在DR 視網(wǎng)膜新生血管中的作用還不清楚，本研究初步證實柚皮素可有效抑制DR 視網(wǎng)膜新生血管的形成。有關(guān)柚皮素在DR 中的作用機制，Al-Dosari 等給糖尿病大鼠口服柚皮素，發(fā)現(xiàn)它能改善糖尿病大鼠體內(nèi)硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)水平的升高和谷胱甘肽水平的降低，能使下降的糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、原肌球蛋白相關(guān)激酶B和突觸素水平升高，改善細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白水平，認(rèn)為柚皮素具有抗糖尿病、抗氧化和抗凋亡的作用，可通過提供神經(jīng)營養(yǎng)支持來阻止DR中的視網(wǎng)膜損傷。自噬是一種重要的細(xì)胞機制，在正常的生理過程中起著“管家”的作用，包括清除長壽、聚集和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，清除受損的細(xì)胞器，調(diào)節(jié)生長和衰老。自噬還涉及多種生物功能，如發(fā)育、細(xì)胞分化、抵御病原體和營養(yǎng)缺乏。LC3是最常用的自噬分子標(biāo)記物，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ在泛素樣反應(yīng)酶的作用下與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成LC3-Ⅱ，采用Western blotting 檢測LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ之間的轉(zhuǎn)化是常用的自噬活性檢測手段。mTOR是自噬信號通路的重要分子，mTOR主要通過其下游分子p70S6K 和eIF4E 調(diào)節(jié)Atg1/ULK等自噬相關(guān)分子的活性，最終發(fā)揮對細(xì)胞自噬的負(fù)性調(diào)控作用，而磷酸化的mTOR（p-mTOR）是通路活化的生物學(xué)標(biāo)志。自噬的分子機制非常復(fù)雜，涉及多個信號通路在各個步驟的協(xié)同作用。近年來研究提示自噬過程參與DR的病理生理學(xué)機制，如mTOR，自噬相關(guān)基因（ATG）等在DR中的表達(dá)水平發(fā)生明顯改變。既往研究提示自噬可被高糖激活，進(jìn)而促進(jìn)RF/6A細(xì)胞的血管生成過程。心血管方面的研究提示，柚皮素可對抗高糖誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞自噬。肺部疾病的研究也發(fā)現(xiàn)，柚皮素可抑制自噬介導(dǎo)的肺炎癥和纖維化，對肺炎支原體感染后氣道重塑發(fā)揮保護(hù)作用。鑒于自噬在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和疾病中的重要性，本研究探討了柚皮素抑制RF/6A血管形成與自噬的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)增加可被柚皮素明顯抑制。高糖條件可減少p-mTOR的表達(dá)，而柚皮素處理可增強p-mTOR的表達(dá)，提示柚皮素可通過增強自噬抑制蛋白mTOR的表達(dá)來減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制血管形成。

在全世界范圍內(nèi)，糖尿病的發(fā)病率正在逐年攀升。糖尿病患者罹患多種全身和眼部疾患，其中最常見的眼部微血管并發(fā)癥就是DR。DR是全球視力下降和失明的主要原因之一，有效防治DR 已是全球關(guān)注的熱點，更是我國亟須解決的重大課題，本研究結(jié)果提示利用具有抗糖尿病和調(diào)節(jié)自噬的黃酮類化合物柚皮素來預(yù)防和治療DR 為臨床提供了一種可能。