湯澎,趙娟,楊光
糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是導(dǎo)致成人致盲的關(guān)鍵原因,大部分患者晚期預(yù)后較差。根據(jù)嚴(yán)重程度,DR 分為增殖性(PDR)與非增殖性(NPDR)兩種類別,其中,以視網(wǎng)膜新生血管為特征的PDR 對患者造成的損傷最為嚴(yán)重。DR的病理機(jī)制十分復(fù)雜,多種因素參與其中。近年來,針對DR 的藥物治療取得了較大進(jìn)展,最主要的是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗劑,但它需要眼內(nèi)重復(fù)注射,費(fèi)用高,易復(fù)發(fā),且長期的生物安全性還有待觀察。因此,尋找安全有效防治視網(wǎng)膜新生血管的藥物具有重要的醫(yī)學(xué)和社會意義。
柚皮素是柚皮苷的苷元,是一種廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物中的二氫黃酮類化合物。研究顯示,柚皮素具有抗炎、清除自由基、抑制過氧化,降血脂以及抑制腫瘤生長等作用,顯示出巨大的藥用價值。眼科領(lǐng)域的研究顯示,柚皮素可在體外抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長,具有抑制大鼠脈絡(luò)膜新生血管的能力。然而,柚皮素對DR 的視網(wǎng)膜新生血管形成的影響還鮮見報(bào)道?;诖耍狙芯孔?019年3―9月采用高糖誘導(dǎo)的RF/6A為模型,評價柚皮素對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成的作用及機(jī)制。
1.1 主要試劑
RF/6A 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫;DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25% 胰酶,胎牛血清購自美國Gibco 公司;柚皮素購自美國Sigma 公司;LC3、mTOR、GAPDH 抗體及HRP 標(biāo)記二抗購自美國Cell signaling 公司;CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室和Matrigel購自美國BD公司。1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞處理及分組
將RF/6A 細(xì)胞置于含有10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,在37 ℃、飽和濕度下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以每孔5.0×10個細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),貼壁后按隨機(jī)數(shù)字表法分組并處理細(xì)胞:對照組在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng),高糖組在DMEM 培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖、高糖+柚皮素組在DMEM 培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖及3 mg/L柚皮素。1.2.2 細(xì)胞增殖
將細(xì)胞以10~10個/孔的密度在96 孔板中,每孔100 μL 培養(yǎng)基,含有或不含有待測化合物。根據(jù)不同分組處理細(xì)胞,然后在二氧化碳培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h。使用重復(fù)移液器向96 孔板的每個孔中加入10 μL CCK-8 溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4 h。在軌道振動器上輕輕混合10 min,使用酶標(biāo)儀測量450 nm 處的吸光度。細(xì)胞增殖率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100。As 為實(shí)驗(yàn)孔吸光度,Ab 為空白孔吸光度,Ac 為對照孔吸光度。1.2.3 細(xì)胞遷移
以每孔5×10/個細(xì)胞將RF/6A 細(xì)胞接種至6 孔板中,37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度條件過夜培養(yǎng)。按照不同分組加藥處理24 h,0.25%胰酶消化收集細(xì)胞,離心去上清,無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,稀釋細(xì)胞濃度至2×10個/毫升。在24 孔板中加入800 μL 含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基,并放入Transwell 小室,在上室分別接入200 μL 各組細(xì)胞懸液,37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出Tran?swell 小室,清洗后用70% 冰乙醇固定細(xì)胞1 h。0.5% 結(jié)晶紫染色,室溫放置20 min,擦凈上室一側(cè)的未遷移的細(xì)胞,顯微鏡下觀察拍照。每個小室隨機(jī)選取3個視野,對遷移的細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)。1.2.4 管腔形成
將Matrigel 放于冰盒中,在4 ℃冰箱中過夜融化,并預(yù)冷槍頭和24 孔板。向24 孔板內(nèi)緩慢加入液態(tài)Matrigel,每孔200 μL,37 ℃孵育1 h。取不同分組的細(xì)胞,消化后用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,以每孔2×l0個將細(xì)胞接種到鋪好膠的24 孔板,37 ℃過夜后顯微鏡拍照,隨機(jī)取3 個放大100倍的視野,Image J軟件對血管腔進(jìn)行計(jì)數(shù)。1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)
常規(guī)提取單層貼壁細(xì)胞總蛋白,測定蛋白濃度和蛋白變性。制備電泳膠,將40 μg 等量總蛋白加樣到SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離。取出凝膠根據(jù)Marker 切下目的條帶,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。在室溫下用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉PVDF 膜2 h,用封閉液稀釋的一抗LC3、mTOR、p-mTOR 及GAPDH(均為1∶1 000)浸泡PVDF 膜,4 ℃孵育過夜。充分洗膜,用稀釋的HRP 標(biāo)記二抗浸泡PVDF 膜,37 ℃搖床孵育2 h。TBST 充分洗膜后ECL 顯色曝光,晾干、掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。2.1 柚皮素促進(jìn)高糖下的細(xì)胞增殖
CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h后,各組RF/6A細(xì)胞均有不同程度生長(圖1)。三組RF/6A 細(xì)胞的增殖率:對照組(99.43±0.07)%,高糖組(72.08±2.12)%,高糖+柚皮素組(90.54±1.47)%。三組間的細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=246.35,P
=0.000);組間兩兩比較顯示,高糖組細(xì)胞增殖率比對照組減?。?p>t=21.31,P
=0.000),柚皮素增加高糖條件下的細(xì)胞增殖率(t
=12.39,P
=0.000)。以上結(jié)果提示,高糖條件下的RF/6A增殖明顯減弱,柚皮素對高糖下的細(xì)胞生長具有保護(hù)作用。圖1 各組RF/6A細(xì)胞形態(tài)(×100):A為對照組;B為高糖組;C為高糖+柚皮素組
2.2 柚皮素抑制高糖下的細(xì)胞遷移
Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組細(xì)胞均發(fā)生不同程度的遷移。對照組、高糖組、高糖+柚皮素組RF/6A細(xì)胞的遷移數(shù)分別為(120.33±6.03)、(149.00±9.17)、(76.33±5.51)個。統(tǒng)計(jì)比較顯示,三組間的細(xì)胞遷移數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=80.03,P
=0.000);組間兩兩比較顯示,高糖組細(xì)胞遷移數(shù)比對照組增加(t
=4.53,P
=0.011),柚皮素減少高糖條件下的細(xì)胞遷移數(shù)(t
=11.77,P
=0.000)(圖2)。以上結(jié)果提示,高糖下的RF/6A 遷移增強(qiáng),柚皮素對高糖下的細(xì)胞遷移具有抑制作用。圖2 各組RF/6A細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色×200):A為對照組;B為高糖組;C為高糖+柚皮素組
2.3 柚皮素抑制高糖下的細(xì)胞管腔形成
Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組細(xì)胞均有管腔樣結(jié)構(gòu)的形成。對照組、高糖組、高糖+柚皮素組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)分別為(11.00±1.00)、(17.33±2.52)、(7.67±1.53)個。統(tǒng)計(jì)比較顯示,三組間的細(xì)胞管腔形成數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=22.45,P
=0.002);組間兩兩比較顯示,高糖組細(xì)胞管腔形成數(shù)比對照組增加(t
=4.05,P
=0.015),柚皮素可減少高糖條件下的細(xì)胞管腔形成數(shù)(t
=5.69,P
=0.005)(圖3)。以上結(jié)果提示,高糖下的RF/6A 血管樣結(jié)構(gòu)形成增強(qiáng),柚皮素對高糖下的細(xì)胞管腔形成具有抑制作用。圖3 各組RF/6A細(xì)胞管腔形成(×100):A為對照組;B為高糖組;C為高糖+柚皮素組
2.4 柚皮素抑制高糖下的自噬激活
Western blot?ting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組、高糖組、高糖+柚皮素組RF/6A 細(xì)胞LC3-Ⅰ的相對表達(dá)量分別為(0.74±0.09)、(0.73±0.15)、(0.78±0.14),三組間比較總體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=0.131,P
=0.880)。對照組、高糖組、高糖+柚皮素組RF/6A 細(xì)胞LC3-Ⅱ的相對表達(dá)量分別為(0.14±0.03)、(0.48±0.05)、(0.28±0.10),三組間比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=18.87,P
=0.003)。組間兩兩比較顯示,高糖組LC-Ⅱ的表達(dá)比對照組增加(t
=9.99,P
=0.001),柚皮素可減少高糖條件下的LC-Ⅱ表達(dá)(t
=3.13,P
=0.035)(圖4)。以上結(jié)果提示,高糖下的RF/6A自噬增強(qiáng),柚皮素對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬具有抑制作用。圖4 各組RF/6A細(xì)胞LC3的蛋白表達(dá)
2.5 柚皮素抑制高糖下自噬激活的機(jī)制
Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組、高糖組、高糖+柚皮素組RF/6A 細(xì)胞mTOR 的相對表達(dá)量為(0.73±0.10)、(0.79±0.07)、(0.83±0.05),三組間比較總體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=1.22,P
=0.359)。對照組、高糖組、高糖+柚皮素組RF/6A 細(xì)胞p-mTOR 的相對表達(dá)量為(0.69±0.09)(0.18±0.04)、(0.58±0.09),三組間比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F
=36.82,P
=0.000)。組間兩兩比較顯示,高糖組p-mTOR的表達(dá)比對照組減少(t
=9.39,P
=0.001),柚皮素可增加高糖條件下的p-mTOR 表達(dá)(t
=6.87,P
=0.002)(圖5)。以上結(jié)果提示,高糖條件下mTOR 信號通路受到抑制,柚皮素可促進(jìn)高糖下mTOR 自噬信號通路的激活。圖5 各組RF/6A細(xì)胞mTOR和p-mTOR的蛋白表達(dá)
DR 的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜,臨床治療棘手,目前主要以防治視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生和抑制其發(fā)展為主。近年來,中藥抑制眼部新生血管形成已經(jīng)成為眼科藥物研究的熱點(diǎn)。酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分,黃酮類化合物是在天然藥物中發(fā)現(xiàn)的主要酚類化合物。有研究顯示,多種黃酮類藥物有較強(qiáng)的抑制眼部新生血管的作用,如柚皮素、柚皮素、芹黃素等。早期對視網(wǎng)膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯示,柚皮素能夠促進(jìn)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖,抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長,同時對這兩種細(xì)胞均有抗氧化作用,認(rèn)為柚皮素是治療老年性黃斑變性的很有前景的候選藥物。本研究利用DR 的細(xì)胞模型,參考上述研究的柚皮素作用濃度,在體外首次觀察了柚皮素對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管形成的影響。結(jié)果提示,柚皮素對高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞存活與增殖具有保護(hù)作用,對細(xì)胞遷移和管腔形成具有明顯的抑制作用,即提示柚皮素能抑制DR 中視網(wǎng)膜新生血管的形成。
柚皮素廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物的果皮和果肉中,如葡萄皮、番茄皮、葡萄柚、橙、枸橘等。近年來,大量國內(nèi)外學(xué)者對柚皮素的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及其在氧化應(yīng)激、炎癥、癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用和在不同疾病中的治療作用進(jìn)行了研究。在細(xì)胞研究方面,Zygmunt 等發(fā)現(xiàn)柚皮素治療能通過增加AMPK 的活化增強(qiáng)L6 肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取。柚皮素可顯著降低3 T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖,且效應(yīng)呈劑量依賴性,伴隨乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的增加而不影響甘油三酯的累積或脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪發(fā)生基因(PPAR-g 和STAT3)的表達(dá)。柚皮素處理人肝癌細(xì)胞HepG2 能明顯減少載脂蛋白B(ApoB)的累積和細(xì)胞膽固醇酯質(zhì)量,降低乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶2(ACAT2)mRNA 水平和微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)的水平和活性,增加低密度脂蛋白(LDL)受體mRNA 水平及LDL 的攝取和降解。這些結(jié)果提示柚皮素的這些效應(yīng)可能會減弱體內(nèi)高血糖、高脂血癥和胰島素抵抗。觀察柚皮素對胰腺β 細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),柚皮素處理大鼠胰腺INS-1E 細(xì)胞,增強(qiáng)了葡萄糖刺激的胰島素分泌和幾個β 細(xì)胞基因的表達(dá),還能降低促凋亡標(biāo)志物mRNA 水平,提示柚皮素在β細(xì)胞中的作用可增加葡萄糖敏感性和防止β 細(xì)胞凋亡。動物實(shí)驗(yàn)表明,在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病動物中應(yīng)用柚皮素可恢復(fù)血糖和血脂水平,減少糖尿病腎病,柚皮素給藥可產(chǎn)生抗炎和抗氧化作用。臨床研究發(fā)現(xiàn),每天攝入柚皮素(5.0 mg/kg)可降低缺血性心臟病、腦血管疾病、特定癌癥和哮喘的死亡率,降低2 型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)。血液中柚皮素水平與肥胖、收縮壓、舒張壓呈負(fù)相關(guān),與血清三酰甘油水平、腰圍、胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān),與血清高密度脂蛋白(HDL)水平呈正相關(guān)。每天給予柚皮素400 mg 8 周,高膽固醇血癥者的血漿總膽固醇和LDL 膽固醇降低,而HDL 和甘油三酯的濃度則不受影響。此外,柚皮素治療顯著降低ApoB 水平,顯著提高紅細(xì)胞SOD 和CAT 活性,降低GSH-Px 活性和血漿TBARS 水平。在另一項(xiàng)研究中,給超重個體服用含有柚皮素的柑橘多酚提取物(900 mg/kg)12 周,其體重和血糖水平顯著降低。
以上細(xì)胞、動物和臨床研究均證實(shí),柚皮素對糖尿病及其并發(fā)癥具有治療作用,但在DR 視網(wǎng)膜新生血管中的作用還不清楚,本研究初步證實(shí)柚皮素可有效抑制DR 視網(wǎng)膜新生血管的形成。有關(guān)柚皮素在DR 中的作用機(jī)制,Al-Dosari 等給糖尿病大鼠口服柚皮素,發(fā)現(xiàn)它能改善糖尿病大鼠體內(nèi)硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)水平的升高和谷胱甘肽水平的降低,能使下降的糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、原肌球蛋白相關(guān)激酶B和突觸素水平升高,改善細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白水平,認(rèn)為柚皮素具有抗糖尿病、抗氧化和抗凋亡的作用,可通過提供神經(jīng)營養(yǎng)支持來阻止DR中的視網(wǎng)膜損傷。自噬是一種重要的細(xì)胞機(jī)制,在正常的生理過程中起著“管家”的作用,包括清除長壽、聚集和錯誤折疊的蛋白質(zhì),清除受損的細(xì)胞器,調(diào)節(jié)生長和衰老。自噬還涉及多種生物功能,如發(fā)育、細(xì)胞分化、抵御病原體和營養(yǎng)缺乏。LC3是最常用的自噬分子標(biāo)記物,當(dāng)自噬發(fā)生時,LC3-Ⅰ在泛素樣反應(yīng)酶的作用下與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成LC3-Ⅱ,采用Western blotting 檢測LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ之間的轉(zhuǎn)化是常用的自噬活性檢測手段。mTOR是自噬信號通路的重要分子,mTOR主要通過其下游分子p70S6K 和eIF4E 調(diào)節(jié)Atg1/ULK等自噬相關(guān)分子的活性,最終發(fā)揮對細(xì)胞自噬的負(fù)性調(diào)控作用,而磷酸化的mTOR(p-mTOR)是通路活化的生物學(xué)標(biāo)志。自噬的分子機(jī)制非常復(fù)雜,涉及多個信號通路在各個步驟的協(xié)同作用。近年來研究提示自噬過程參與DR的病理生理學(xué)機(jī)制,如mTOR,自噬相關(guān)基因(ATG)等在DR中的表達(dá)水平發(fā)生明顯改變。既往研究提示自噬可被高糖激活,進(jìn)而促進(jìn)RF/6A細(xì)胞的血管生成過程。心血管方面的研究提示,柚皮素可對抗高糖誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞自噬。肺部疾病的研究也發(fā)現(xiàn),柚皮素可抑制自噬介導(dǎo)的肺炎癥和纖維化,對肺炎支原體感染后氣道重塑發(fā)揮保護(hù)作用。鑒于自噬在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和疾病中的重要性,本研究探討了柚皮素抑制RF/6A血管形成與自噬的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)增加可被柚皮素明顯抑制。高糖條件可減少p-mTOR的表達(dá),而柚皮素處理可增強(qiáng)p-mTOR的表達(dá),提示柚皮素可通過增強(qiáng)自噬抑制蛋白mTOR的表達(dá)來減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,進(jìn)而抑制血管形成。
在全世界范圍內(nèi),糖尿病的發(fā)病率正在逐年攀升。糖尿病患者罹患多種全身和眼部疾患,其中最常見的眼部微血管并發(fā)癥就是DR。DR是全球視力下降和失明的主要原因之一,有效防治DR 已是全球關(guān)注的熱點(diǎn),更是我國亟須解決的重大課題,本研究結(jié)果提示利用具有抗糖尿病和調(diào)節(jié)自噬的黃酮類化合物柚皮素來預(yù)防和治療DR 為臨床提供了一種可能。